液滴微流控芯片系統(tǒng)中微液滴特性表征及氨基酸檢測(cè)應(yīng)用

袁會(huì)領(lǐng)，董立兵，涂然，杜文斌，賈士儒，王欽宏

1天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津300457

2中國(guó)科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所中國(guó)科學(xué)院系統(tǒng)微生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300308

3中國(guó)人民大學(xué)化學(xué)系，北京100872

高通量篩選與工業(yè)育種

液滴微流控芯片系統(tǒng)中微液滴特性表征及氨基酸檢測(cè)應(yīng)用

袁會(huì)領(lǐng)1,2，董立兵3，涂然2，杜文斌3，賈士儒1，王欽宏2

1天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津300457

2中國(guó)科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所中國(guó)科學(xué)院系統(tǒng)微生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300308

3中國(guó)人民大學(xué)化學(xué)系，北京100872

袁會(huì)領(lǐng),董立兵,涂然,等.滴微流控芯片系統(tǒng)中微液滴特性表征及氨基酸檢測(cè)應(yīng)用.生物工程學(xué)報(bào),2014,30(1): 139?146.

Yuan HL,Dong LB,Tu R,et al.Micro-droplet characterization and its application for amino acid detection in droplet microfluidic system.Chin J Biotech,2014,30(1):139?146.

基于液滴微流控芯片的檢測(cè)和篩選系統(tǒng)，因其具有通量高、成本低等顯著特點(diǎn)，近年來備受關(guān)注。該系統(tǒng)生成的微液滴(皮升體積)具有直徑均一、大小可控、互不交融(單分散性)等特性，它作為微反應(yīng)器可以進(jìn)行微生物及其代謝物包埋實(shí)驗(yàn)和高通量檢測(cè)。因此，研究微液滴的相關(guān)特性及其應(yīng)用具有重要意義。文中在液滴微流控芯片系統(tǒng)搭建的基礎(chǔ)上，對(duì)重要氨基酸(谷氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)分別進(jìn)行了微液滴包埋實(shí)驗(yàn)，研究了包埋微液滴的重要特性參數(shù)(如穩(wěn)定性、擴(kuò)散性等)，探索了包埋微液滴對(duì)氨基酸檢測(cè)分選的應(yīng)用。實(shí)驗(yàn)表明，文中搭建的液滴微流控芯片系統(tǒng)可以穩(wěn)定、均一地生成微液滴，微液滴大小可根據(jù)需要控制在20?50μm之間，微液滴間無交叉污染，包埋氨基酸的微液滴的檢測(cè)篩選速度大約為每分鐘600個(gè)。這個(gè)研究為高通量分析和篩選產(chǎn)氨基酸的微生物奠定了基礎(chǔ)。

微流控芯片，高通量篩選，微液滴，穩(wěn)定性，擴(kuò)散性

微生物是工業(yè)生物技術(shù)的核心與基礎(chǔ)[1]。利用先進(jìn)的現(xiàn)代自動(dòng)化和儀器分析技術(shù)開發(fā)的高通量篩選平臺(tái)，具有自動(dòng)化、標(biāo)準(zhǔn)化、高通量化等特征，大大突破了人工篩選在速度、效率和標(biāo)準(zhǔn)化等方面的限制，是微生物菌種篩選的一次技術(shù)革命。然而，已經(jīng)投入使用的各類高通量篩選系統(tǒng)主要是由國(guó)外公司開發(fā)的價(jià)值昂貴、操作復(fù)雜的大型裝備系統(tǒng)，其普適性受到較大的限制。因此，開發(fā)操作簡(jiǎn)單、成本相對(duì)不高的高通量篩選系統(tǒng)是重要的發(fā)展方向，特別是近年來基于微流控芯片的檢測(cè)和篩選系統(tǒng)更是受到極大的關(guān)注[2-3]。

微流控芯片系統(tǒng)(Microfluidics)或微流控芯片實(shí)驗(yàn)室，是將化學(xué)和生物等領(lǐng)域中所涉及的樣品制備、反應(yīng)、分離、檢測(cè)及細(xì)胞培養(yǎng)、分選和裂解等基本操作單元集成到幾個(gè)平方厘米(甚至更小)的芯片上，由微通道形成網(wǎng)絡(luò)，由可控流體貫穿整個(gè)系統(tǒng)[4]。目前的微流控芯片系統(tǒng)主要包括連續(xù)微流體系統(tǒng)和液滴微流體系統(tǒng)?；谶B續(xù)微流體的微流控芯片系統(tǒng)研究較多，已經(jīng)成功應(yīng)用在蛋白和核酸的電泳分析上[5-6]，并有商品化的分析儀。相對(duì)于連續(xù)微流體系統(tǒng)，基于液滴微流體的微流控芯片系統(tǒng)最大的優(yōu)勢(shì)在于可以形成獨(dú)立的單個(gè)微液滴反應(yīng)器[7-8]，可以據(jù)此對(duì)分析樣品進(jìn)行單獨(dú)包埋并在相互分開、互不干擾的微液滴小室中進(jìn)行檢測(cè)分析，使得檢測(cè)和篩選細(xì)胞或其胞外分泌產(chǎn)物成為可能。該系統(tǒng)具有速度快、通量高、成本低等顯著特點(diǎn)[9-10]，對(duì)開展定向進(jìn)化改造工程用酶，研究外分泌胞外產(chǎn)物(代謝產(chǎn)物)等相關(guān)研究領(lǐng)域[11-13]具有重要的推動(dòng)作用。

由于微生物篩選實(shí)驗(yàn)通常需要較長(zhǎng)的時(shí)間，所以對(duì)微流控芯片中的微液滴有更高的要求，如提高微液滴的穩(wěn)定性，優(yōu)化生物兼容性以及防止微液滴內(nèi)水相物質(zhì)滲漏到油相等。本研究針對(duì)以上問題，以代謝產(chǎn)物(氨基酸)為研究對(duì)象，通過對(duì)包埋氨基酸的皮升級(jí)微液滴特性的研究，為液滴微流控芯片系統(tǒng)在氨基酸檢測(cè)和相應(yīng)生產(chǎn)菌株的高通量篩選以及定向進(jìn)化改造方面奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

含有pET30a-mCherry的大腸桿菌Escherichia coli BL21(DE3)菌株來由實(shí)驗(yàn)室保存，該菌株可以誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)生熒光蛋白mCherry，用于檢測(cè)微液滴的生物活性兼容性。

1.1.2 儀器與芯片

532 nm激光器購自長(zhǎng)春新產(chǎn)業(yè)光電技術(shù)有限公司；聚焦物鏡購自奧林巴斯公司；Nikon1 J1高速攝像機(jī)購自Nikon公司；532 nm、610 nm濾光片均購自北京卓立漢光儀器有限公司；光電倍增管購自Centurian Surplus公司；PCI6070e數(shù)據(jù)采集卡購自National Instruments公司；MODEL 609E-6高壓放大器購自Trek公司；Mitos壓力泵購自環(huán)球分析測(cè)試儀器有限公司；硅片購自上海齊鳴硅材料有限公司；SU-8 2025光膠購自美國(guó)MicroChem公司；等離子清洗機(jī)購自美國(guó)Harrick公司；勻膠機(jī)購自中國(guó)科學(xué)院微電子研究所；加熱臺(tái)購自誼華電子設(shè)備有限公司；紫外光刻機(jī)購自中國(guó)科學(xué)院光電技術(shù)研究所；微流控芯片為自制PDMS芯片，PDMS購自Momentive公司。

1.1.3 主要試劑

Abil EM90購自Evonik Degussa公司；礦物油、鈣黃綠素、Span80、CuCl2、EDTANa2均購自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；各種氨基酸均購自Solarbio公司；IPTG(異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷)、氨基酸氧化酶和過氧化氫酶均購自Sigma公司；丙二醇甲醚醋酸酯購自阿法埃莎(天津)化學(xué)有限公司；異丙醇購自北京化工廠；熒光底物Amplex UltraRed購自Invitrogen公司。

圖1 液滴微流控芯片整合控制系統(tǒng)示意圖Fig.1Diagram of droplet microfluidic system.

1.2 方法

1.2.1 液滴微流控芯片整合控制系統(tǒng)的搭建(光路設(shè)置、數(shù)據(jù)采集和控制系統(tǒng))及工作流程

如圖1所示，本液滴微流控芯片整合控制系統(tǒng)采用非聚焦光路[14]。

激光器發(fā)出波長(zhǎng)為532 nm，發(fā)射后的激光通過濾光片除去雜波，然后聚焦到微流控芯片的檢測(cè)點(diǎn)。當(dāng)包埋熒光物質(zhì)的微液滴通過檢測(cè)點(diǎn)時(shí)被激發(fā)產(chǎn)生熒光，熒光經(jīng)聚焦物鏡聚焦后到達(dá)分光鏡。通過分光鏡將一部分熒光傳給高速攝像機(jī)，實(shí)時(shí)監(jiān)控微液滴的流動(dòng)情況；另一部分熒光則通過濾光片，由光電倍增管(PMT)接收并將熒光信號(hào)轉(zhuǎn)化為電壓信號(hào)后，由數(shù)據(jù)采集卡采集并由LabVIEW軟件進(jìn)行分析。高壓放大器用于微液滴的偏轉(zhuǎn)，當(dāng)目標(biāo)微液滴的檢測(cè)信號(hào)超過分選設(shè)定閾值時(shí)，分析軟件通過高壓放大器和微流控芯片上的電極對(duì)微液滴施加偏轉(zhuǎn)電壓。由于介電電泳力的作用，目標(biāo)微液滴將發(fā)生偏轉(zhuǎn)，流至分選通道得到收集。

1.2.2 液滴微流控檢測(cè)分選芯片制備和微液滴生成

微流控芯片通過模塑法制備[4,15]。首先根據(jù)要求利用AutoCAD軟件設(shè)計(jì)芯片圖形(圖2A)并獲得相應(yīng)的光刻掩模(掩模由深圳美精微光電股份有限公司制作)，然后通過光刻法將圖形轉(zhuǎn)移到芯片上。具體步驟是：首先選取潔凈的硅片，放到等離子機(jī)清洗4 min，然后用勻膠機(jī)以1 800 r/min的轉(zhuǎn)速均勻的覆蓋一層50 μm的SU-8 2025光膠，并在95℃下預(yù)烘30 min；待其冷卻后在光刻掩模下紫外曝光20 s，在95℃烘40 min；將未曝光的光膠用丙二醇甲醚醋酸酯和丙三醇交替沖洗干凈，在110℃下加熱30 min，即獲得所需芯片通道的陽模。芯片由目前被廣泛采用的PDMS材料制作，PDMS具有較好的透氣性、良好的透光性和生物兼容性[15-16]。將PDMS預(yù)制劑和交聯(lián)劑以10：1的比例均勻混合后，倒在制備好的陽模上，在60℃下加熱4 h使其固化。揭下該含有微流通道的PDMS并與另一塊平整的PDMS封合，即得所需芯片，芯片實(shí)物如圖2B所示。微流控芯片以Mitos壓力泵作為流體動(dòng)力，利用PEEK材質(zhì)的塑料管將其與芯片連接，采用流動(dòng)聚焦(Flow-focusing)方式在芯片內(nèi)生成微液滴[17-18]。

圖2 微流控芯片設(shè)計(jì)示意圖(A)及實(shí)物圖(B)Fig.2Design diagram of the microfluidic chip(A) and photograph of PDMS microfluidic chip(B).The chip contains an oil inlet(OIL)that joins two aqueous inlet channels(EM1 and EM2)at two narrow junctions. The channels are 40μm deep.The channels before the electrodes are 50μm wide.The channel on the side of the electrodes leading to the“SORT”output is 40μm wide,whilethechannelfurthestfromelectrodes leading to the“WST”output is 60μm wide.

1.2.3 微液滴特性研究和氨基酸包埋檢測(cè)分析

利用微流控芯片生成油包水(w/o)的微液滴，通過包埋含有pET30a-mCherry的E.coli細(xì)胞并檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)熒光蛋白的表達(dá)量，測(cè)定由不同表面活性劑組成的微液滴對(duì)細(xì)胞活性的影響作用。根據(jù)微液滴的形態(tài)學(xué)檢測(cè)，對(duì)生成的微液滴的穩(wěn)定性進(jìn)行研究。參照Kendall等研究方法[19-20]對(duì)微液滴的分子擴(kuò)散情況進(jìn)行研究。

氨基酸的熒光檢測(cè)采用雙酶偶聯(lián)法[10,21-22]。以谷氨酸與熒光底物Amplex UltraRed反應(yīng)后的混合體系作為水相，以添加非離子型表面活性劑的礦物油為油相，生成包埋氨基酸反應(yīng)體系的皮升體積微液滴，并對(duì)微液滴進(jìn)行在線的熒光檢測(cè)和篩選。通過類似方法對(duì)苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸也進(jìn)行了檢測(cè)。

圖3 微液滴的生成Fig.3Generation of monodispensed micro-droplets on the microfluidic chip.The 14 pL aqueous droplets (30μm)were generated in mineral oil containing surfactant by flow-focusing.Scale=100μm.

圖4 表面活性劑對(duì)微液滴內(nèi)細(xì)胞活性的影響Fig.4Effect of surfactants on cell viability in micro-droplets.

2 結(jié)果與分析

2.1 微液滴的生成

如圖3所示，利用流動(dòng)聚焦(Flow focusing)方式生成微液滴，通過改變油、水兩相的流速可獲得理想大小的微液滴。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，自行設(shè)計(jì)的芯片生成的微液滴具有良好的單分散性(微液滴間相互獨(dú)立)和均一性，微液滴直徑可控制在20?50μm范圍內(nèi)，生成速度每分鐘600?1 200個(gè)。

2.2 微液滴的生物活性兼容性

油包水(w/o)微液滴作為微反應(yīng)器用于細(xì)胞培育或者代謝產(chǎn)物的反應(yīng)，都要求微液滴有較好的生物兼容性，因而油相組分，尤其是表面活性劑的選擇非常重要[11]。相對(duì)于離子型表面活性劑，非離子型表面活性劑對(duì)細(xì)胞和蛋白不造成強(qiáng)靜電作用力的損害，因此，具有更好的生物活性兼容性。本研究對(duì)目前使用較多的w/o非離子型表面活性劑Span80和Abil EM90進(jìn)行了測(cè)定。實(shí)驗(yàn)中以分別添加3%(V/V) Span80和3%(V/V)Abil EM90的礦物油作為油相，對(duì)添加IPTG的E.coli BL21(DE3)(含有pET30a-mCherry)細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行微液滴包埋，并對(duì)微液滴進(jìn)行37℃靜置培養(yǎng)。通過測(cè)定不同時(shí)間點(diǎn)微液滴的熒光值(Ex/Em:490 nm/ 585 nm)來反映微液滴內(nèi)的細(xì)胞蛋白生物表達(dá)量。如圖4所示，添加表面活性劑Abil EM90的礦物油包埋的E.coli細(xì)胞具有更高的熒光蛋白表達(dá)量，表面活性劑Abil EM90比Span80有更好的生物兼容性(圖4)。故本實(shí)驗(yàn)最終選擇含3%(V/V)Abil EM90的礦物油作為油相。

2.3 微液滴的穩(wěn)定性

微液滴需要在一定時(shí)間內(nèi)保持穩(wěn)定存在，從而為其檢測(cè)篩選提供基礎(chǔ)。因此，穩(wěn)定性是微液滴的重要指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)將谷氨酸等4種氨基酸分別進(jìn)行微液滴包埋，對(duì)生成的微液滴在離線條件下室溫培養(yǎng)，利用顯微照相系統(tǒng)觀察不同時(shí)間點(diǎn)微液滴的穩(wěn)定狀態(tài)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，微液滴室溫培養(yǎng)20 h后形態(tài)仍然保持穩(wěn)定(圖5)。對(duì)比培養(yǎng)前，98%的微液滴無融合和破裂，可以有效滿足細(xì)胞產(chǎn)生相關(guān)熒光信號(hào)檢測(cè)的要求。

2.4 微液滴的分子擴(kuò)散

在培養(yǎng)過程中，如果微液滴內(nèi)包埋的水相物質(zhì)擴(kuò)散到液滴外，并進(jìn)入到另外一個(gè)微液滴內(nèi)，必然影響檢測(cè)和分選的效率，所以微液滴間低分子擴(kuò)散與否非常重要。好的微液滴應(yīng)該是包埋物質(zhì)既沒有滲透到微液滴外，也沒有在液滴間發(fā)生交叉污染。擴(kuò)散性是微液滴作為互不干擾的獨(dú)立微反應(yīng)器的重要指標(biāo)。參照Kendall等人提出的方法對(duì)微液滴分子擴(kuò)散情況進(jìn)行了檢驗(yàn)[19-20]。

采用含3%(V/V)Abil EM90的礦物油作為油相，5 mmol/L鈣黃綠素、10 mmol/L CuCl2、0.1 mmol/L谷氨酸混合液作為水相1，乳化成的微液滴為E1；50 mmol/L EDTANa2作為水相2，乳化成的微液滴為E2；水相1和水相2以體積比1∶5混合作為水相3，乳化成的微液滴為E3；微液滴E1和微液滴E2以體積比1∶5混合為微液滴ME，測(cè)定4種微液滴在不同時(shí)間點(diǎn)的熒光值(Ex/Em：490 nm/515 nm)。結(jié)果表明，室溫培養(yǎng)20 h后，微液滴ME的熒光值幾乎沒有變化，微液滴間的分子交換＜2%，對(duì)微液滴的檢測(cè)和分選影響可以忽略(圖6)。因此，選擇含3%(V/V)Abil EM90的礦物油作為油相生成的微液滴內(nèi)物質(zhì)無明顯的分子擴(kuò)散，可作為微反應(yīng)體系。

圖5 微液滴穩(wěn)定性Fig.5Stability of micro-droplets.Micro-droplets from the custom-designed droplet microfluidic system were stable and did not coalesce after 20 h incubation at room temperature.Scale=100μm.

圖6 微液滴間的分子交換Fig.6Aqueous phase exchange between micro-droplets. The sample E3 represents as a positive control with high fluorescence signal.The sample E1 and E2 represents the droplets alone and the sample ME represents the droplets after mix of E1 and E2.

2.5 氨基酸包埋微液滴的檢測(cè)與分選

在上述研究基礎(chǔ)上，利用搭建的液滴微流控芯片系統(tǒng)對(duì)氨基酸進(jìn)行了檢測(cè)與分選。實(shí)驗(yàn)以兩種濃度的谷氨酸(10μmol/L和20μmol/L)為檢測(cè)對(duì)象，通過液滴包埋，在圖2所示的芯片中生成含有兩種谷氨酸濃度的微液滴，生成速度為每分鐘600個(gè)。

兩種不同濃度氨基酸包埋微液滴的熒光檢測(cè)信號(hào)如圖7所示。其中，包埋20μmol/L谷氨酸的微液滴熒光值高于設(shè)定的閥值，軟件自動(dòng)給出信號(hào)到高壓放大器，產(chǎn)生偏轉(zhuǎn)電壓使微液滴受介電力作用偏轉(zhuǎn)至“SORT”孔道，微液滴被分選，而包埋10μmol/L谷氨酸的微液滴不會(huì)被分選，流向“WST”孔道。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本研究設(shè)計(jì)的液滴微流控芯片系統(tǒng)具有氨基酸檢測(cè)與分選功能，檢測(cè)分選通量可達(dá)到每分鐘600個(gè)。

圖7 谷氨酸微液滴的熒光檢測(cè)與分選Fig.7Detectionandsortingofthemixed micro-droplets with 10μmol/L and 20μmol/L glutamic acid,respectively.When the PMT signal from the florescenceinthemicro-dropletwith20μmol/L glutamic acid is higher than the threshold(in gray),the dielectrophoretic sorting is triggered via the response of AC pulse(black bar)and micro-droplet will flow into‘SORT’channel.Otherwise,the sorting is not triggeredandthemicro-dropletwith10μmol/L glutamic acid will flow into‘WST’channel.

3 總結(jié)

液滴微流控芯片的優(yōu)勢(shì)在于可以形成相互獨(dú)立無干擾的單個(gè)微液滴反應(yīng)器，如果將每一個(gè)微液滴看成一個(gè)微反應(yīng)器或者細(xì)胞培養(yǎng)器進(jìn)行高通量的檢測(cè)與分選，將為研究外分泌胞外產(chǎn)物(代謝產(chǎn)物)及其工程菌株的定向進(jìn)化提供強(qiáng)有力的篩選平臺(tái)。

本研究搭建的液滴微流控芯片高通量篩選平臺(tái)具有設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單、操作方便等特點(diǎn)。利用該平臺(tái)進(jìn)行了包埋氨基酸的微液滴的生成、微液滴特性研究和熒光檢測(cè)與分選實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：1)生成的微液滴直徑可控，大小均一、穩(wěn)定，微液滴內(nèi)反應(yīng)體系小，可節(jié)省大量試劑；2)微液滴可以長(zhǎng)時(shí)間穩(wěn)定存在，滿足試劑反應(yīng)或細(xì)胞培養(yǎng)對(duì)時(shí)間的要求；3)微液滴的包埋物在測(cè)試微液滴中穩(wěn)定存在，微液滴間無交叉污染，不會(huì)對(duì)后期微液滴的熒光檢測(cè)和分選產(chǎn)生影響；4)微液滴的篩選通量可達(dá)每分鐘600個(gè)。這些實(shí)驗(yàn)為酶及氨基酸等細(xì)胞分泌物的檢測(cè)分析和相應(yīng)生產(chǎn)菌株的篩選提供了高通量篩選的可能，對(duì)液滴微流控芯片在定向進(jìn)化方面的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

REFERENCES

[1]Parekh S,Vinci VA,Strobel RJ.Improvement of microbial strains and fermentation processes.Appl Microbiol Biotechnol,2000,54(3):287–301.

[2]Olsen M,Iverson B,Georgiou G.High-throughput screeningofenzymelibraries.CurrOpin Biotechnol,2000,11(4):331–337.

[3]BaretJC,MillerOJ,TalyV,etal. Fluorescence-activateddropletsorting(FADS): efficientmicrofluidiccellsortingbasedon enzymaticactivity.LabChip,2009,9(13): 1850–1858.

[4]Lin BC,Qin JH.Microfluidics Based Laboratory onaChip.Beijing:SciencePress,2006(in Chinese).林炳承,秦建華.微流控芯片實(shí)驗(yàn)室.北京:科學(xué)出版社,2006.

[5]King KR,Wang SH,Irimia D,et al.A highthroughput microfluidic real-time gene expression living cell array.Lab Chip,2007,7(1):77–85.

[6]White AK,Vanlnsberghe M,Hamidi M,et al. High-throughput microfluidic single-cell RT-qPCR. ProcNatlAcadSciUSA,2011,108(34): 13999–14004.

[7]Courtois F,Olguin LF,Whyte G,et al.Controlling theretentionofsmallmoleculesinemulsion microdroplets for use in cell-based assays.Anal Chem,2009,81(8):3008–3016.

[8]TehSY,LinR,HungLH,etal.Droplet microfluidics.Lab Chip,2008,8(2):198–220.

[9]UmbanhowarPB,PrasadV,WeitzDA. Monodisperse emulsion generation via drop break off in a coflowing stream.Langmuir,2000,16(2): 347–351.

[10]AgrestiJJ,AntipovE,AbateAR,etal. Ultrahigh-throughputscreeningindrop-based microfluidics for directed evolution.Proc Natl Acad Sci USA,2010,107(9):4004–4009.

[11]MarcouxPR,DupoyM,MatheyR,etal. Micro-confinement of bacteria into w/o emulsion dropletsforrapiddetectionandenumeration. Colloids Surfaces A:Physicochem Eng Aspects, 2011,377(1):54–62.

[12]Kang LF,Chung BG,Langer R,et al.Microfluidics for drug discovery and development:from target selection to product lifecycle management.Drug Discov Today,2008,13(1):1–13.

[13]JoenssonHN,Andersson-SvahnH.Droplet microfluidics--a tool for protein engineering and analysis.Lab Chip,2011,11(24):4144–4147.

[14]Huo DQ,Liu Z,Hou CJ,et al.Recent advances on opticaldetectionmethodsandtechniquesfor cell-based microfluidic systems.Chin J Anal Chem, 2010,38(9):1357–1365(in Chinese).霍丹群,劉振,侯長(zhǎng)軍,等.微流控芯片光學(xué)檢測(cè)技術(shù)在細(xì)胞研究中的應(yīng)用與進(jìn)展.分析化學(xué), 2010,38(9):1357–1365.

[15]Zhou JW,Ellis AV,Hans VN.Recent developments in PDMS surface modification for microfluidic devices.Electrophoresis,2010,31(1):2–16.

[16]Shao JB,Wu L,Jin QH,et al.Fabrication and application of a novel cell culture microchip.Chin J Biotech,2008,24(7):1253–1257(in Chinese).邵建波,吳蕾,金慶輝,等.一種細(xì)胞培養(yǎng)微芯片的制作及應(yīng)用.生物工程學(xué)報(bào),2008,24(7): 1253–1257.

[17]Ward T,Faivre M,Abkarian M,et al.Microfluidic flow focusing:Drop size and scaling in pressure versus flow-rate-driven pumping.Electrophoresis, 2005,26(19):3716–3724.

[18]Chen JS,Jiang JH.Droplet microfluidic technique: mirodroplets formation and manipulation.Chin J Anal Chem,2012,40(8):1293–1300(in Chinese).陳九生,蔣稼歡.微流控液滴技術(shù):微液滴生成與操控.分析化學(xué),2012,40(8):1293–1300.

[19]Mastrobattista E,Taly V,Chanudet E,et al. High-throughput screening of enzyme libraries:in vitroevolutionofaβ-galactosidaseby fluorescence-activated sorting of double emulsions. Chem Biol,2005,12(12):1291–1300.

[20]Kendall DA,MacDonald RC.A fluorescence assay to monitor vesicle fusion and lysis.J Biol Chem, 1982,257(23):13892–13895.

[21]SunL,ZhangH,YuanHL,etal.A double-enzyme-coupled assay for high-throughput screening of succinic acid-producing strains.Appl Microbiol,2013,114(6):1696–1701.

[22]BaretJC,MillerOJ,TalyV,etal. Fluorescence-activateddropletsorting(FADS): efficient microfluidic cell sorting based on enzymatic activity.Lab Chip,2009,9(13):1850–1858.

(本文責(zé)編陳宏宇)

July 20,2013;Accepted:November 21,2013

Ran Tu.Tel/Fax:+86-22-84861950;E-mail:tu_r@tib.cas.cn Qinhong Wang.Tel/Fax:+86-22-84861950;E-mail:wang_qh@tib.cas.cn

Micro-dropletcharacterizationanditsapplicationfor amino acid detection in droplet microfluidic system

Huiling Yuan1,2,Libing Dong3,Ran Tu2,Wenbin Du3,Shiru Jia1,and Qinhong Wang2
1 College of Biotechnology,Tianjin University of Science&Technology,Tianjin 300457,China
2 Key Laboratory of Systems Microbial Biotechnology,Tianjin Institute of Industrial Biotechnology,Chinese Academy of Sciences, Tianjin 300308,China
3 Department of Chemistry,Renmin University of China,Beijing 100872,China

Recently,the droplet microfluidic system attracts interests due to its high throughput and low cost to detect and screen.The picoliter micro-droplets from droplet microfluidics are uniform with respect to the size and shape,and could be used as monodispensed micro-reactors for encapsulation and detection of single cell or its metabolites.Therefore,it is indispensable to characterize micro-droplet and its application from droplet microfluidic system.We first constructed the custom-designed droplet microfluidic system for generating micro-droplets,and then used the micro-droplets to encapsulate important amino acids such as glutamic acid,phenylalanine,tryptophan or tyrosine to test the droplets’properties, including the stability,diffusivity and bio-compatibility for investigating its application for amino acid detection and sorting.The custom-designed droplet microfluidic system could generate the uniformed micro-droplets with a controllable size between 20 to 50μm.The micro-droplets could be stable for more than 20 h without cross-contamination or fusion each other.The throughput of detection and sorting of the system is about 600 micro-droplets per minute.This study provides a high-throughput platform for the analysis and screening of amino acid-producing microorganisms.

microfluidic chip,high throughput screening,micro-droplet,stability,diffusivity

Supported by:Instrument Developing Project of the Chinese Academy of Sciences(No.YZ201153),National Natural Science Foundation of China(Nos.21206162,21205134).