隨機(jī)突變提高單胺氧化酶活性

陳雪君，馬元慧,，邵建華，賴敦岳，王志國，陳振明

1 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 310036

2 杭州師范大學(xué)生物催化研究室，浙江 杭州 311121

3 浙江臺州清泉醫(yī)藥化工有限公司，浙江 臺州 317300

4 杭州師范大學(xué)衰老研究所，浙江 杭州 311121

隨機(jī)突變提高單胺氧化酶活性

陳雪君1，馬元慧1,2，邵建華3，賴敦岳2，王志國4，陳振明2

1 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 310036

2 杭州師范大學(xué)生物催化研究室，浙江 杭州 311121

3 浙江臺州清泉醫(yī)藥化工有限公司，浙江 臺州 317300

4 杭州師范大學(xué)衰老研究所，浙江 杭州 311121

陳雪君, 馬元慧, 邵建華, 等. 隨機(jī)突變提高單胺氧化酶活性. 生物工程學(xué)報, 2014, 30(1): 109?118.

Chen XJ, Ma YH, Shao JH, et al. Increasing activity of a monoamine oxidase by random mutation. Chin J Biotech, 2014, 30(1): 109?118.

前期獲得了一個對底物美西律具有一定活性的單胺氧化酶突變體A-1 (F210V/L213C)。為進(jìn)一步提高其酶活性，利用MegaWHOP PCR構(gòu)建了庫容約為104的隨機(jī)突變庫。篩選后獲得了一個最優(yōu)突變酶ep-1，比活力為A-1的189%。選擇性測定結(jié)果表明，酶的對映體選擇性有較大提高，E值由101提高到282；動力學(xué)常數(shù)測定揭示，酶催化效率有較大提高，kcat/Km由0.001 51 mmol/(L?s)提高到0.002 89 mmol/(L?s)。和A-1酶相比，在所測定的11種胺類底物中，ep-1對其他7種底物的比活力有較明顯提高，對其他4種底物的比活力變化不大。序列分析表明，ep-1的突變?yōu)門162A。分子動力學(xué)模擬結(jié)果提示，該突變主要通過修正通道氨基酸的二級結(jié)構(gòu)和擴(kuò)大活性口袋來發(fā)揮作用。

單胺氧化酶，易錯PCR，酶活力，分子動力學(xué)模擬

美西律 (圖1) 是一種鈉通道阻斷劑，臨床上常以消旋的形式用作抗心律失常藥和鎮(zhèn)痛劑。藥理學(xué)研究表明[1-2]，美西律的R-型對映體優(yōu)先和心臟鈉通道結(jié)合；與S構(gòu)型相比，(R)-美西律與人骨骼肌纖維的結(jié)合作用更強(qiáng)。因此，有必要開展美西律的手性合成研究[3]。

美西律對映體的合成有過多篇報道，其中包括消旋中間體的拆分，N-乙酰衍生物的酶水解以及多步立體選擇性合成[4-6]。最近，Koszelewski等[7]利用ω-轉(zhuǎn)氨酶進(jìn)行了消旋美西律的去消旋化研究。通過一鍋二步反應(yīng)，底物濃度為28 mmol/L時，反應(yīng)48 h后消旋美西律可被完全轉(zhuǎn)化為(S)-或(R)-美西律，產(chǎn)物ee值可超過99%，得率97%；但是其中一個比較明顯的問題是反應(yīng)中需要用到多種酶，包括 (S) -ω-轉(zhuǎn)氨酶、(R)-ω-轉(zhuǎn)氨酶、氨基酸氧化酶和脫氫酶。

利用單胺氧化酶(MAO, EC 1.4.3.4)進(jìn)行拆分是一種很有潛力的獲得手性胺的方法[8-9]。單胺氧化酶為黃素酶，可選擇性地將消旋胺的一個對映體氧化為亞胺，亞胺與酶解離后在水中分解為酮與氨(圖1)。如果單胺氧化酶的對映體選擇性足夠高，反應(yīng)速度較慢的對映體在反應(yīng)速度快的對映體反應(yīng)完全后成為光學(xué)純的手性胺。利用來自黑曲霉的MAO, Turner等[10]在反應(yīng)體系中加入硼烷這種簡單廉價的還原劑，使“廢物”亞胺被還原為消旋的胺，這些胺再進(jìn)行第二次酶催化氧化反應(yīng)。兩個反應(yīng)循環(huán)進(jìn)行，最終可得到100%的光學(xué)純手性胺[9]。這一體系是“一鍋”式反應(yīng)，而且反應(yīng)不需要添加通常氧化還原酶所需要的輔助因子。另外，Turner等的研究證實[11-12]，MAO-N在酶改造后有可能大幅度提高酶活力，并具備廣泛的底物譜，其中包括環(huán)狀二級胺和三級胺等。

MAO-N-D5是Turner實驗室經(jīng)過多輪定向進(jìn)化獲得的含5個突變位點的黑曲霉MAO突變子[8]，具高度應(yīng)用潛力。但是我們的前期研究表明，MAO-N-D5對消旋美西律基本無活性；經(jīng)過基于CASTing的半理性定向進(jìn)化研究，我們獲得了一個有一定活性的單胺氧化酶突變體A-1 (F210V/L213C)。本研究以此為起點，探討通過隨機(jī)突變進(jìn)一步提高酶活性的可能性。

1 材料與方法

1.1 基因、菌種與質(zhì)粒

MAO-N-D5由南京金斯瑞公司優(yōu)化合成；大腸桿菌Escherichia coli DH5α，Escherichia coli BL21 (DE3)和JM109(DE3)均為本實驗室保存菌種；表達(dá)質(zhì)粒pET-28a(+)購自Novagen公司。

圖1 美西律選擇性拆分過程Fig. 1 Kinetic resolution process of rac-mexiletine to R-mexiletine by monoamine oxidase.

1.2 酶和試劑

限制性內(nèi)切酶NdeⅠ、BamHⅠ購自英國NEB公司；DNA聚合酶KOD-plus-neo、高效連接酶ligation high和磷酸化酶PNK購自上海東洋紡生物科技有限公司；PCR cleaning試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、凝膠回收試劑盒和超級感受態(tài)細(xì)胞JM109 (DE3) 等購自杭州愛思進(jìn)生物技術(shù)有限公司。

IPTG、卡那霉素和十二烷基磺酸鈉購自上海生工生物工程有限公司；TBHBA、鹽酸美西律、香草酸、DAB和4-AAP購自Sigma公司；辣根過氧化酶購自德國Roche公司；融合蛋白純化試劑盒MagExtractor-His-tag購自美國GE公司；液相分析用試劑正己烷、三乙胺和乙醇等均為色譜純試劑，購自百靈威科技有限公司。

1.3 易錯PCR

以編碼A-1的基因 (后均用a-1表示) 序列為模板，設(shè)計易錯PCR引物。上游引物: 5'-ATGACGAGCCGCGACGGTTACCAAT-3'；下游引物：5'-CAGACGGGCTTTCACTTCGCGTTT C-3'。易錯PCR反應(yīng)體系為：反應(yīng)體積50 μL，MgCl27 mmol/L，MnCl2和dNTPs各0.2 mmol/L，dCTP和dTTP各1 mmol/L，10× PCR緩沖液5 μL，pET-28a-a-1 10 ng，上下游引物各0.3 μmol/L，Taq聚合酶1.25 U。易錯PCR反應(yīng)條件：預(yù)變性，94 ?C 2 min；98 ?C 20 s，58 ?C 15 s，72 ?C 2 min，28個循環(huán)；72 ?C 5 min。

1.4 易錯PCR突變文庫的構(gòu)建

反應(yīng)體系組成：反應(yīng)體積50 μL，純化的易錯PCR 產(chǎn)物0.5 μL, pET-28a-a-1 0.5 μL, MgCl21.5 mmol/L，dNTPs 0.2 mmol/L, 10×緩沖液5 μL，KOD-plus-neo 1 μL。MegaWHOP PCR反應(yīng)條件為：68 ?C 5 min；預(yù)變性，94?C 2 min；95 ?C 20 s，55 ?C 20 s，68 ?C 180 s，25個循環(huán)；68 ?C 5 min。其中反應(yīng)體系先在68 ?C保溫5 min的目的是利用KOD聚合酶3'-5'外切酶活性，切除epPCR在擴(kuò)增產(chǎn)物的3'端引入的A堿基[15]。

往上述50 μL MegaWHOP PCR產(chǎn)物中加入2 μL甲基化酶DpnⅠ，37 ?C放置1.5 h。該步目的是去除甲基化的母鏈模板。然后取DpnⅠ消化的PCR產(chǎn)物5 μL，轉(zhuǎn)化入超級感受態(tài)細(xì)胞JM109 (DE3)；37 ?C培養(yǎng)箱過夜后，沖洗平板上的菌體，提取質(zhì)粒。

1.5 突變文庫的篩選

1.5.1 平板初篩

配制平板篩選顯色液[13]：往20 mL磷酸緩沖液 (100 mmol/L, pH 7.4) 加入1%高純度瓊脂糖，微波加熱至瓊脂完全溶解，冷卻至50 ?C后加入DAB至終濃度 0.5 g/L，緩慢攪動至DAB完全溶解后加入辣根過氧化物酶 (終濃度2 U/mL) 與目標(biāo)底物 (終濃度10 mmol/L)，45 ℃溫浴待用。

篩選過程[13]：將1.4中獲得的隨機(jī)突變質(zhì)粒5 μL轉(zhuǎn)化入BL21 (DE3) 感受態(tài)細(xì)胞中，涂板于5個覆蓋有硝酸纖維素膜的含卡那霉素抗性的LB平板上，37 ?C培養(yǎng)8–10 h；然后將長有菌落的硝酸纖維素膜揭下，覆蓋于含1 mmol/L IPTG的LB平板上，20 ?C培養(yǎng)14 h；揭下硝酸纖維素膜，平鋪于滅菌的干凈平板底部，將冷卻至40 ?C左右的平板顯色液迅速倒入平板內(nèi)，使顯色液完全浸沒硝酸纖維素膜；待顯色緩沖液凝固后，將平板放入37 ?C培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每0.5 h觀察一次；當(dāng)出現(xiàn)棕色菌落時，用滅菌牙簽挑取，接種，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.2 96孔板復(fù)篩

配制顯色液[14]：100 mmol/L磷酸緩沖液(pH 7.4)，4-AAP(4-aminoantipyrine) 7.5 mmol/L，0.2% (W/V)香草酸，辣根過氧化物酶4 U/mL，鹽酸美西律10 mmol/L。

篩選過程[14]：將初篩得到的菌落接種于2 mL LB液體培養(yǎng)基中用IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng) (方法見1.6) 后收集菌體，洗滌后破碎取上清液；往透明96孔板加入顯色液，每孔90 μL，再分別加入10 μL上清液；封口，37 ?C培養(yǎng)箱中放置20 min，觀察顏色變化。

1.6 酶基因的測序、表達(dá)及酶純化測序由南京金斯瑞公司完成。

誘導(dǎo)表達(dá)：將經(jīng)初篩和復(fù)篩獲得的目標(biāo)菌落接種于LB培養(yǎng)基中，37 ?C振蕩培養(yǎng)至OD600約為0.4?0.6；添加IPTG至終濃度1 mmol/L，25 ?C，200 r/min，誘導(dǎo)16 h，超聲波破碎后取上清液，利用融合蛋白純化試劑盒MagExtractor-His-tag對重組蛋白進(jìn)行純化，最后按Bradford法測定其蛋白質(zhì)的含量。

1.7 酶活力測定

根據(jù)Braun等[15]報道的方法，測定純化的單胺氧化酶的活力。其中酶反應(yīng)液的配置過程為：5 mL磷酸緩沖液(1 mol/L, pH 7.6)，500 μL 2,4,6-三溴-3-羥基苯甲酸(2%，溶于DMSO)，37.5 μL 4-AAP (1 mol/L)，50 μL辣根過氧化物酶(終濃度2 U/mL)，20 μL消旋鹽酸美西律(終濃度10 mmol/L)，補(bǔ)足水至50 mL。往1 mL 酶反應(yīng)液中加入10 μL純化的酶液，37 ?C反應(yīng)10 min后，測定510 nm吸光值。酶活單位定義為：37 ?C下每分鐘催化生成1 μmol 過氧化氫所需的酶量為一個酶活力單位(U)。kcat和Km值的測定采用Linewaver-Burk 雙倒數(shù)作圖法, 選用的底物濃度分別為1、2.5、5、10、20、40和80 mmol/L。

1.8 單胺氧化酶拆分反應(yīng)

拆分反應(yīng)和樣品制備：反應(yīng)體系包含100 μL純化的酶液，消旋美西律10 mmol/L，50 mmol/L磷酸緩沖液 (pH 7.6)，總體積2 mL。37 ℃、200 r/min振蕩反應(yīng)24 h；取200 μL反應(yīng)液，加入氯化鈉至飽和，加入2 mL異丙醇，振蕩，從鹽水中萃取底物和產(chǎn)物；取出上層有機(jī)相，加入無水氯化鈣固體顆粒干燥并用0.45 μm濾膜過濾后，進(jìn)行液相分析。HPLC分析條件：手性色譜柱Chiralcel AS-H (Daicel Chemical Industries, Japan，φ0.46×25)，流動相為正己烷/乙醇 (94/6, V/V)，流速1 mL/min，柱溫35 ?C，檢測波長274 nm。

1.9 分子機(jī)制分析

1.9.1 分子對接

應(yīng)用分子對接軟件AutoDock[16]，針對MAO-N-D5單胺氧化酶晶體結(jié)構(gòu)[17-18](PDB ID：2VVM) 和底物鹽酸美西律 (R型和S型) 進(jìn)行了分子對接研究，以揭示二者之間的作用模式。對接應(yīng)用Lamarckian genetic algorithm，蛋白酶分子采用Kollman電荷[19-20]，相互作用的格點空間以FAD末端為中心，大小為60×60×60，其他參數(shù)采用軟件默認(rèn)，分別進(jìn)行150次獨(dú)立的對接運(yùn)算。對接結(jié)果按照其構(gòu)象之間的均方根偏差RMSD進(jìn)行分組，以1.0 ?為標(biāo)準(zhǔn)。最后選取含有構(gòu)象最多的分組中對接自由能最高的構(gòu)象作為單胺氧化酶和鹽酸美西律潛在的結(jié)合構(gòu)象。

1.9.2 分子動力學(xué)

為研究殘基突變對蛋白酶三維結(jié)構(gòu)的影響，我們以MAO-N-D5單胺氧化酶的晶體結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)，應(yīng)用Chimera軟件[21]分別構(gòu)建了突變體A-1和ep-1的三維結(jié)構(gòu)，然后應(yīng)用Gromacs軟件[22]分別對A-1和ep-1體系進(jìn)行分子動力學(xué)研究，以得到平衡狀態(tài)下兩突變體的穩(wěn)定構(gòu)象。首先將兩個體系分別置于大小為78 ? × 78 ? × 78 ?周期性水盒子中 (水分子采用TIP3P模型)，并在AMBER99SB力場下相繼應(yīng)用最陡下降法和共軛梯度法分別對體系進(jìn)行3 000步的能量最小化運(yùn)算；然后進(jìn)行模擬退火運(yùn)算，使體系在300 ps內(nèi)由0 K逐步升溫到300 K；隨后對體系進(jìn)行200 ps的限制性動力學(xué)計算，以進(jìn)一步優(yōu)化溶劑環(huán)境；最后采用NPT系綜分別進(jìn)行20 ns的動力學(xué)運(yùn)算，使體系達(dá)到動力學(xué)平衡狀態(tài)。

圖2 易錯PCR核酸電泳圖Fig. 2 Result of epPCR. M: standard nucleic acid molecular weight; 1, 2, 3: three samples of parallel epPCR.

2 結(jié)果與分析

2.1 易錯PCR突變庫的構(gòu)建

首先以A-1基因為模板，按照易錯PCR常規(guī)條件 (高濃度Mg2+和不均衡dNTPs濃度) 進(jìn)行隨機(jī)突變。易錯PCR結(jié)果如圖2所示，目的條帶在1 500 bp附近，與理論值1 488 bp接近。

傳統(tǒng)上，隨機(jī)突變文庫的構(gòu)建過程涉及雙酶切、回收、連接和轉(zhuǎn)化等多個步驟，效率低下。本研究根據(jù)MegaWHOP[23]的原理，以易錯PCR產(chǎn)物為引物，以攜帶a-1基因的質(zhì)粒為模板，經(jīng)過相對簡單的PCR擴(kuò)增和DpnⅠ處理，即可用于轉(zhuǎn)化超級感受態(tài)細(xì)胞JM109 (DE3)。這種方法節(jié)約時間，減少并簡化實驗步驟，提高突變效率。取MegaWHOP PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入超級感受態(tài)細(xì)胞JM109 (DE3)，培養(yǎng)過夜，收集菌體后提取質(zhì)粒，即獲得隨機(jī)突變庫。質(zhì)粒檢測結(jié)果如圖3所示。

2.2 突變庫的篩選

2.2.1 平板篩選

單胺氧化酶在催化胺的過程中產(chǎn)生微量過氧化氫，后者能被辣根過氧化物酶與二氨基聯(lián)苯胺捕獲，從而使有單胺氧化酶活性的菌落顯棕色。根據(jù)這一原理篩選了大約10 000個菌落的隨機(jī)突變庫，挑取90個陽性菌落進(jìn)行復(fù)篩。

2.2.2 96孔板篩選

單胺氧化酶催化反應(yīng)所產(chǎn)生的過氧化氫在辣根過氧化物酶作用下，以4-AAP (4-aminoantipyrine)作為氫供體，被還原為水分子，4-AAP則以其氧化態(tài)存在，并與香草酸形成紅色物質(zhì)醌亞胺。通過紅色的深淺，可初步判定單胺氧化酶活力的高低[24]。根據(jù)這一原理在96孔板上進(jìn)行復(fù)篩，挑選顏色最深的10個突變菌株，進(jìn)行下一步的工作。

2.3 突變酶的活力測定及酶催化性質(zhì)的初步分析

將96孔板篩選獲得的10個突變株，進(jìn)行基因表達(dá)和蛋白純化后測定比活力。選出比活力最高的6個菌株進(jìn)行DNA測序，結(jié)果表明有3個突變株發(fā)生了突變，其中ep-1的突變?yōu)門162A, ep-7為W262L/D287N, ep-10為T324A。這3個突變株的相對比活力測定結(jié)果 (表1) 表明：ep-1的比活力比A-1提高了89%；另兩個菌株則差別不大，甚至有所下降。

圖3 Mega PCR核酸電泳圖Fig. 3 Result of Mega PCR. M: nucleic acid marker; 1, 2：two samples of Mega PCR；3：plasmid pET28a-MAO-N-D5.

表1 突變菌株的活力測定Table 1 Specific activities of wild-type and mutant MAO enzymes

為驗證篩選到的突變株的手性選擇性，利用純化酶進(jìn)行消旋美西律的拆分反應(yīng)。結(jié)果 (表2) 顯示，ep-1是效果最好的突變子，對映體過量值和出發(fā)酶A-1一樣，均在99%以上，表征對映體選擇性的E值則由101提高到282；另外兩個突變酶的選擇性則較A-1有所下降。

以A-1為對照，進(jìn)一步測定突變子ep-1的動力學(xué)參數(shù)。測定結(jié)果表明(表3)，與A-1相比，ep-1的Km值由60.74 mmol/L降低到35.94 mmol/L；ep-1的kcat值有所增加，但是并不明顯；kcat/Km由0.001 51 mmol/(L·s) 提高到0.002 89 mmol/(L·s)。

2.4 突變酶的底物特異性分析

以11種胺類物質(zhì)為底物，包括非手性胺、手性一級胺、二級胺、芳香胺和脂肪胺，測定MAO-N-D5、A-1和ep-1三種酶的底物特異性，結(jié)果見表4?？梢钥闯觯琫p-1的相對活力總體比A-1活力高。與未突變的MAO-N-D5相比，A-1與ep-1對其中1、2、4和6四種底物的活力有較大提升，其他則變化不明顯。

2.5 MAO-底物結(jié)合模式及突變體三維結(jié)構(gòu)分析

表2 美西律拆分反應(yīng)Table 2 Specific conversions of MAO variants to mexiletine enantiomers

表3 突變酶的動力學(xué)常數(shù)Table 3 Kinetic comparison of two mutant MAO enzymesa

圖4 MAO-N-D5與底物(S)-鹽酸美西律的結(jié)合模式Fig. 4 Binding conformation of MAO-N-D5 and (S)-mexiletine.

應(yīng)用分子對接研究得到了代表性底物鹽酸美西律和MAO-N-D5的結(jié)合模式 (圖4)。圖中底物為鹽酸美西律(S)-異構(gòu)體，其手性C原子以粉紅色圓球標(biāo)出。據(jù)MAO對手性胺的催化機(jī)制可知，只有在這種取向下，底物手性C上的H原子才能有效地轉(zhuǎn)移到輔酶FAD上，進(jìn)而完成催化反應(yīng)；R型異構(gòu)體手性C上的H原子取向與S型相反，朝向遠(yuǎn)離FAD的方向，導(dǎo)致R型底物不能被有效催化，這也是MAO-N-D5蛋白酶對底物具有手性拆分能力的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)[17]。圖4中還可以看到，以藍(lán)青色標(biāo)出的Trp430、Phe466和Trp94三個保守性殘基將輔酶FAD和底物緊緊包圍在一個較小的疏水性的口袋中，從而導(dǎo)致該蛋白酶對分子較大或極性較高的底物催化能力較差。

表4 突變酶底物特異性Table 4 Substrate specificity of MAO-N-D5 mutantsa,b

為了揭示殘基突變?nèi)绾卧诮Y(jié)構(gòu)進(jìn)而在功能上影響MAO-N-D5，我們將達(dá)到分子動力學(xué)平衡狀態(tài)的突變體A-1和ep-1的三維結(jié)構(gòu)與MAO-N-D5的晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)行了疊加，其催化中心附近殘基 (以輔酶FAD末端異咯嗪N5原子為中心，周圍10 ?以內(nèi)的所有殘基) 的疊加情況見圖5。由圖可知，3個結(jié)構(gòu)大部分結(jié)構(gòu)均能較好的重疊 (MAO-N-D5、A-1和ep-1的結(jié)構(gòu)分別標(biāo)記為黃色、綠色和紅色)，表明相關(guān)突變沒有導(dǎo)致MAO-N-D5的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生巨大變化。但是，圖中有兩個值得注意的地方：其一，藍(lán)青色Trp430、Phe466和Trp94的位置。每個突變體上3個殘基均比突變前更向外擴(kuò)展，其中以ep-1在Trp94 loop上的表現(xiàn)最為明顯，這表明兩個突變體A-1和ep-1能夠依次容納更大的底物；其二，圓桶中緊鄰催化中心的結(jié)構(gòu)。該結(jié)構(gòu)處在底物進(jìn)出活性口袋的通道上，在MAO-N-D5為柔性較低的α-helix，在A-1中為loop和α-helix的結(jié)合，而在ep-1中則全部為柔性較高的loop結(jié)構(gòu)。顯然loop結(jié)構(gòu)在酶結(jié)合較大的底物分子時較α-螺旋更為有利。正是以上兩點結(jié)構(gòu)上的變化為A-1和ep-1在催化鹽酸美西律及類似底物時表現(xiàn)出更強(qiáng)的催化能力創(chuàng)造了結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。圖中并未標(biāo)出第210、213和162號突變殘基，這是由于3個殘基距離FAD末端異咯嗪部分較遠(yuǎn)，超出了催化中心的范圍。這種結(jié)構(gòu)特征表明殘基突變并非與活性中心殘基相關(guān)，而是通過改變其所屬的二級結(jié)構(gòu)來擴(kuò)大活性口袋從而間接發(fā)揮作用的。

圖5 突變體A-1 (綠色) 和ep-1 (紅色) 與MAO-N-D5 (黃色) 催化中心三維結(jié)構(gòu)的疊加Fig. 5 3D superimposition of catalytic centers of A-1, ep-1 and MAO-N-D5.

3 討論

經(jīng)過平板初篩、96孔板復(fù)篩及酶活測定，獲得了1個突變子ep-1，其所包含的突變T162A使酶活提高了89%。選擇性測定結(jié)果顯示，ep-1的對映體過量值和A-1相似，ees均在99%以上；表征對映體選擇性的E值則有較大幅度的提高。這說明T162A突變提高了酶催化反應(yīng)的選擇性。

動力學(xué)測定結(jié)果表明，ep-1的Km值明顯降低, 表明ep-1對底物的親和力有所提高，表征催化底物氧化的能力的kcat值則增加不明顯。綜合兩個結(jié)果，T162A突變顯著提高了酶的催化效率 (kcat/Km)。分子對接和分子動力學(xué)研究表明T162A突變在穩(wěn)定保持活性中心殘基構(gòu)象的基礎(chǔ)上，使得活性通道氨基酸的二級結(jié)構(gòu)由A-1的loop-helix結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變?yōu)橥耆母呷嵝詌oop結(jié)構(gòu)，從而為底物的高效結(jié)合與催化創(chuàng)造了條件。

盡管ep-1比A-1的比酶活提高了89%，但是實際上仍只是具備了初步活性，離工業(yè)化應(yīng)用所需要的酶活還有較長的距離[25]，需通過進(jìn)一步的優(yōu)化進(jìn)行改造。

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(本文責(zé)編 陳宏宇)

Increasing activity of a monoamine oxidase by random mutation

Xuejun Chen1, Yuanhui Ma1,2, Jianhua Shao3, Dunyue Lai2, Zhiguo Wang4, and Zhenming Chen2
1 College of Life and Environmental Sciences, Hangzhou Normal University, Hangzhou 310036, Zhejiang, China
2 Laboratory of Biocatalysis, Hangzhou Normal University, Hangzhou 311121, Zhejiang, China
3 Zhejiang Taizhou Qingquan Medical & Chemical Co. Ltd., Taizhou 317300, Zhejiang, China
4 Institute of Aging Research, Hangzhou Normal University, Hangzhou 311121, Zhejiang, China

The monoamine oxidase mutant A-1 (F210V/L213C) from Aspergillus niger showed some catalytic activity onmexiletine. To futher improve its activity, the mutant was subjected to directed evolution with MegaWHOP PCR (Megaprimer PCR of Whole Plasmid) and selection employing a high-throughput agar plate-based colorimetric screen. This approach led to the identification of a mutant ep-1, which specific activity was 189% of that for A-1. The ep-1 also showed significantly improved enantioselectivity, with the E value increased from 101 to 282; its kinetic kcat/Kmvalue increased from 0.001 51 mmol/(L?s) to 0.002 89 mmol/(L?s), suggesting that catalytic efficiency of ep-1 had been improved. The mutant showed obviously higher specific activities on 7 of all tested 11 amines substrates, and the others were comparable. Sequence analysis revealed that there was a new mutation T162A on ep-1. The molecular dynamics simulation indicated that T162A may affect the secondary structure of the substrate channel and expand the binding pocket.

monoamine oxidase, error-prone PCR, activity, molecular dynamics simulation

July 25, 2013; Accepted: September 30, 2013

Zhenming Chen. Tel/Fax: +86-571-28869373; E-mail: zmchen05@gmail.com Zhiguo Wang. Tel: +86-571-28861733; E-mail: zhgwang@aliyun.com

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