基于2-C-甲基-D-赤蘚糖醇-4磷酸途徑的產(chǎn)紫槐二烯大腸桿菌構(gòu)建及其補(bǔ)糖策略優(yōu)化

汪建峰，熊智強(qiáng)，張嗣良，王勇

1華東理工大學(xué)生物反應(yīng)器工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海200237

2中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院植物生理生態(tài)研究所合成生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海200032

基于2-C-甲基-D-赤蘚糖醇-4磷酸途徑的產(chǎn)紫槐二烯大腸桿菌構(gòu)建及其補(bǔ)糖策略優(yōu)化

汪建峰1,2，熊智強(qiáng)2，張嗣良1，王勇2

1華東理工大學(xué)生物反應(yīng)器工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海200237

2中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院植物生理生態(tài)研究所合成生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海200032

汪建峰,熊智強(qiáng),張嗣良,等.基于2-C-甲基-D-赤蘚糖醇-4磷酸途徑的產(chǎn)紫槐二烯大腸桿菌構(gòu)建及其補(bǔ)糖策略優(yōu)化.生物工程學(xué)報(bào),2014,30(1):64?75.

Wang JF,Xiong ZQ,Zhang SL,et al.Engineering MEP pathway in Escherichia coli for amorphadiene production and optimizing the bioprocess through glucose feeding control.Chin J Biotech,2014,30(1):64?75.

2-C-甲基-D-赤藻糖醇-4-磷酸(2-methyl-D-erythritol-4-phosphate,MEP)途徑是大腸桿菌Escherichia coli唯一的萜類前體合成途徑，研究表明它比甲羥戊酸(Mevalonate,MVA)途徑具有更高的理論產(chǎn)率。但目前有關(guān)MEP途徑的調(diào)控所知非常有限，故單獨(dú)強(qiáng)化MEP途徑對(duì)萜類異源合成產(chǎn)量的提高效果并不理想。研究中通過引入外源MEP途徑基因強(qiáng)化E.coli萜類合成的遺傳改造策略和發(fā)酵過程補(bǔ)糖控制優(yōu)化，嘗試更有效地釋放MEP途徑的潛力，建立青蒿素前體——紫槐二烯的高密度發(fā)酵過程。研究結(jié)果表明共表達(dá)阿維鏈霉菌Streptomyces avermitilis dxs2基因和枯草芽胞桿菌Bacillus subtilis idi基因可使紫槐二烯的搖瓶發(fā)酵產(chǎn)量比野生菌株提高12.2倍。隨后針對(duì)該菌株建立了高密度發(fā)酵過程，發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定期的中前期(24?72 h)是產(chǎn)物合成的關(guān)鍵期，通過穩(wěn)定期補(bǔ)糖速率的調(diào)整，明顯改善了產(chǎn)物合成速度，使紫槐二烯的產(chǎn)量從2.5 g/L提高到了4.85 g/L，但不影響產(chǎn)物積累的周期?？紤]到72 h后菌體老化可能會(huì)影響產(chǎn)物合成，進(jìn)一步采取了調(diào)整對(duì)數(shù)期的補(bǔ)糖速率控制菌體生長(zhǎng)的策略，使紫槐二烯的產(chǎn)量達(dá)到6.1 g/L。研究結(jié)果為基于MEP途徑的萜類異源合成工程菌構(gòu)建及其發(fā)酵工藝的建立奠定了基礎(chǔ)。

MEP途徑，紫槐二烯，大腸桿菌，高密度發(fā)酵，補(bǔ)糖速率

近十年隨著合成生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，以常見的微生物如大腸桿菌Escherichia coli和釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae作為通用底盤細(xì)胞構(gòu)建高效細(xì)胞工廠，已經(jīng)成為大規(guī)模生產(chǎn)植物源珍稀天然產(chǎn)物的重要手段[1-4]。青蒿素作為最有效的抗瘧疾藥物，其前體紫槐二烯及青蒿酸的微生物合成受到了廣泛的關(guān)注。加州大學(xué)伯克利分校的研究人員通過在S.cerevisiae中改造甲羥戊酸(MVA)途徑或在E.coli中引入外源MVA途徑的策略成功地構(gòu)建了高產(chǎn)紫槐二烯(Amorphadiene)和青蒿酸的工程菌[5-6]。

與所有的萜類化合物一樣，紫槐二烯是由萜類通用前體——異戊烯焦磷酸(IPP)和二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)裝配合成的。野生型E.coli以2-C-甲基-D-赤藻糖醇-4-磷酸(MEP)途徑作為唯一的萜類前體合成途徑[7]。在過去的十多年研究人員針對(duì)E.coli MEP途徑采取了簡(jiǎn)單強(qiáng)化或精細(xì)調(diào)控關(guān)鍵基因表達(dá)的策略，使重組菌株的紫杉二烯和β-胡蘿卜素產(chǎn)量分別提高到1 g/L和2.1 g/L的[8-9]。Partow等[10]和Meng等[11]分別利用全基因組水平in silico代謝通量分析發(fā)現(xiàn)MEP途徑比MVA途徑具有更高的理論產(chǎn)率。但受限于MEP途徑特性及調(diào)控機(jī)制研究不成熟，大多數(shù)情況下改造MEP途徑所取得的效果與引入更成熟的MVA途徑具有一定的差距[6,12-13]，尤其是Keasling等通過對(duì)引入MVA途徑進(jìn)行一系列的改造后[6]，使E.coli能夠合成27.4 g/L的紫槐二烯。此外，對(duì)MEP途徑的改造效果往往隨著基因表達(dá)強(qiáng)度、宿主菌株以及下游產(chǎn)物的變化而變化[12,14-15]。因此MEP途徑仍需要有更多的研究來進(jìn)一步釋放潛力。此外，除工程菌的遺傳改造外，目前針對(duì)萜類化合物異源合成的發(fā)酵過程主要是基于傳統(tǒng)高密度蛋白表達(dá)工藝建立的[16-17]，仍缺乏針對(duì)性的發(fā)酵控制策略的研究?？紤]到萜類合成與蛋白表達(dá)在基因表達(dá)和細(xì)胞代謝調(diào)控兩個(gè)層次上存在很大差異，如蛋白表達(dá)過程往往采取先生長(zhǎng)后表達(dá)的策略，盡可能多地讓表達(dá)階段的物質(zhì)和能量用于蛋白質(zhì)合成，而異源合成需要平衡前體和下游途徑基因表達(dá)，合理分配物質(zhì)和能量代謝流，使細(xì)胞減少副產(chǎn)物積累，盡可能多地支持目標(biāo)產(chǎn)物的合成[18]。因此仍需要針對(duì)某個(gè)特定的異源合成工程菌株開展更深入的發(fā)酵過程研究，了解產(chǎn)物合成與菌體生長(zhǎng)代謝的關(guān)系，以便在反應(yīng)器水平最大限度地發(fā)揮菌株潛力。

本研究擬從引入異源MEP途徑基因構(gòu)建紫槐二烯異源合成工程菌株和菌株高密度發(fā)酵過程的糖流加控制策略兩個(gè)方面入手，嘗試最大限度地釋放E.coli內(nèi)源MEP途徑合成紫槐二烯的潛力，為開發(fā)基于MEP途徑的萜類異源合成工程菌株及其發(fā)酵工藝奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒、菌株、引物及相關(guān)試劑

本研究相關(guān)的質(zhì)粒與引物如表1所示。菌株E.coli DH10B(Invitrogen)作為克隆宿主，E.coli BL21(DE3)(Novagen)作為產(chǎn)物合成的宿主。分子克隆相關(guān)的酶、DNA片段與質(zhì)粒抽提純化試劑盒分別由NEB公司、TaKaRa公司及Axygen公司提供。石竹烯標(biāo)準(zhǔn)品和十二烷分別由Sigma-Aldrich公司和上海一基生物試劑有限公司提供。各培養(yǎng)基組分、抗生素及其他相關(guān)試劑購(gòu)自O(shè)xoid、國(guó)藥集團(tuán)與上海生物工程有限公司。本研究中各抗生素的工作濃度如下：氨芐青霉素100 mg/L，卡那霉素50 mg/L。以下研究中根據(jù)菌株所含質(zhì)粒的抗性添加抗生素。除發(fā)酵培養(yǎng)基外，補(bǔ)料培養(yǎng)基也按相同的濃度添加，不再做特別說明。

1.2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建

質(zhì)粒pJF23(圖2A)由本實(shí)驗(yàn)室保存[19]，含有編碼E.coli法尼基焦磷酸合成酶基因(ispA)和密碼子優(yōu)化后的紫槐二烯合成酶基因(ads)的T7 Prom-ispA-ads-T7 Term人工操作子[23]。以相應(yīng)菌株的基因組為模板，分別PCR擴(kuò)增E.coli MG1655的1-脫氧木酮糖-5-磷酸合成酶的基因(dxs_EC)和異戊二烯焦磷酸異構(gòu)酶的基因(idi_EC)，阿維鏈霉菌(Streptomyces avermitilis MA 4680T的dxs2_SAV，枯草芽胞桿菌(Bacillus subtilis CMCC63501)的idi_BS。將基因dxs_EC、idi_EC、dxs2_SAV和idi_BS的PCR產(chǎn)物回收，并用限制性內(nèi)切酶酶切后，連接到pET21d載體的相應(yīng)位點(diǎn)上，獲得質(zhì)粒pJF39、pJF44、pJF554和pJF567。用XbaⅠ和XhoⅠ酶切pJF44，回收含idi_EC基因的DNA片段，將其插入到pJF39的SpeⅠ和XhoⅠ位點(diǎn)上，獲得質(zhì)粒pJF63。用XbaⅠ和SpeⅠ酶切pJF554，回收含idi_BS基因的DNA片段，將其插入到pJF568的SpeⅠ位點(diǎn)上，獲得重組質(zhì)粒經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證，選擇dxs2_SAV和idi_BS基因插入方向一致的克隆，命名為pJF678(圖2A)。

表1 本研究涉及的質(zhì)粒與引物序列Table 1Plasmids and primers involved in this study

1.3 工程菌的發(fā)酵研究

1.3.1 發(fā)酵培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基(g/L)：NaCl 10,蛋白胨10,酵母抽提物5。

搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：Na2HPO4·7H2O 12.8，KH2PO43，NaCl 0.5，NH4Cl 1.0，MgSO4·7H2O 0.493，CaCl2·2H2O 0.0147，葡萄糖8。

補(bǔ)料分批培養(yǎng)基(體積1 L)[6]：基礎(chǔ)料含K2HPO4·3H2O 15.7 g，KH2PO44.2 g，檸檬酸1.7 g， (NH4)2SO42 g葡萄糖15 g，MgSO4·7H2O 1.2 g和微量元素溶液Ⅰ10 mL。補(bǔ)料培養(yǎng)基含葡萄糖650 g，MgSO4·7H2O 12 g，(NH4)2SO410.7 g和微量元素溶液Ⅱ10 mL。微量元素溶液Ⅰ(g/L)含有CoCl2·6H2O 0.25，MnCl2·4H2O 1.5，CuCl2·2H2O 0.15，H3BO40.3，Na2MoO4·2H2O 0.25，Zn(CH3COO)2·2H2O 1.3和檸檬酸三鐵10。微量元素溶液Ⅱ(g/L)含有CoCl2·6H2O 0.4，MnCl2·4H2O 2.35，CuCl2·2H2O 0.25，H3BO40.5，Na2MoO4·2H2O 0.4，Zn(CH3COO)2·2H2O 1.6和檸檬酸三鐵4。

1.3.2 發(fā)酵種子的制備

將質(zhì)粒pJF23與MEP途徑改造相關(guān)的質(zhì)粒(pET21d作為空白對(duì)照)共轉(zhuǎn)化BL21(DE3)，挑取單菌落至10 mL液體LB培養(yǎng)基中，37℃、250 r/min過夜培養(yǎng)12 h，用15 mL無菌離心管離心收集菌體后，加入等體積15%的甘油懸浮，–80℃凍存后作為搖瓶發(fā)酵種子和補(bǔ)料分批發(fā)酵的一級(jí)種子。

將–80℃凍存的甘油種子以1%的接種量接種到含50 mL LB培養(yǎng)基的500 mL搖瓶中，37℃、250 r/min培養(yǎng)6 h，作為補(bǔ)料分批發(fā)酵二級(jí)種子。

1.3.3 搖瓶發(fā)酵

取10 mL搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基于100 mL的搖瓶中，按2%的接種量將–80℃凍存的甘油種子接種到搖瓶中，同時(shí)加入20%的十二烷和終濃度為0.1 mmol/L的異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)進(jìn)行初始誘導(dǎo)，置于250 r/min、28℃的搖床上發(fā)酵培養(yǎng)3 d或者5 d后，進(jìn)行產(chǎn)物檢測(cè)。

1.3.4 發(fā)酵罐系統(tǒng)配置與參數(shù)采集

采用上海國(guó)強(qiáng)生化工程裝備公司生產(chǎn)的5 L發(fā)酵罐系統(tǒng),配有溶氧、溫度和pH電極，罐體和補(bǔ)料稱重裝置，SHP8400PMS過程氣體質(zhì)譜儀等在線監(jiān)測(cè)設(shè)備。發(fā)酵過程溶氧、溫度、pH、氧攝取速率(OUR)和二氧化碳釋放速率(CER)等在線參數(shù)由Biostar 2.0(由華東理工大學(xué)國(guó)家生化工程技術(shù)研究中心(上海)開發(fā))軟件包采集計(jì)算。

1.3.5 補(bǔ)料分批發(fā)酵

按5%的接種量，將二級(jí)種子接種到裝液量為1 L的發(fā)酵罐中。為了減少菌體生長(zhǎng)延遲期，發(fā)酵過程的初始溫度為37℃，轉(zhuǎn)速恒定800 r/min，通氣量維持在1 vvm，自動(dòng)補(bǔ)加氨水控制pH為 7.0。經(jīng)過約3 h的延遲期后，菌體開始進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，約7 h后菌體濃度(OD600)達(dá)到–10左右后，迅速降溫至28℃，并加入200 mL十二烷和終濃度為0.1 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)。隨后待基礎(chǔ)料中葡萄糖耗盡，溶氧開始回升后，開始流加碳源。整個(gè)發(fā)酵過程分兩個(gè)階段控制糖的流加，按圖1所示分別對(duì)各工藝對(duì)數(shù)期和穩(wěn)定期的流加速率進(jìn)行控制。待OD600至200左右以后(進(jìn)入穩(wěn)定期)，將補(bǔ)料速度設(shè)定為恒定速率補(bǔ)加。

圖1 各過程的補(bǔ)糖速率Fig.1Profile of glucose addition rate of each feed-batch fermentation process in this study.

1.4 發(fā)酵過程離線參數(shù)檢測(cè)、質(zhì)粒穩(wěn)定性分析與紫槐二烯的定量

殘?zhí)菨舛葯z測(cè)：采用二硝基水楊酸法[20]。

銨離子濃度檢測(cè)：采用苯酚-次氯酸鹽法[21]。

質(zhì)粒穩(wěn)定性測(cè)試：在無菌條件下，將培養(yǎng)液稀釋進(jìn)行梯度稀釋，選取合適的梯度涂布無抗性LB固體平板和加有氨芐青霉素和卡那霉素雙抗性的平板。用抗性平板單菌落數(shù)與無抗性平板單菌落數(shù)的比值表征雙質(zhì)粒系統(tǒng)穩(wěn)定性。

乙酸檢測(cè)：色譜條件為TSKgel ODS-100ZC18色譜柱(250 mm×25 mm,5 μm)，流動(dòng)相為25 mmol/L KH2PO4緩沖液(pH 2.5)：乙腈=98∶2，流速1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm，柱溫30℃；紫槐二烯定量：按Tsuruta等[6]報(bào)道的條件，采用GC-MS (Thermo Scientific TRACE GC-ISQ)對(duì)紫槐二烯進(jìn)行定量。取500μL的發(fā)酵液(保證十二烷均勻分布)，用等體積的乙酸乙酯進(jìn)行萃取一次，離心收集有機(jī)相，用乙酸乙酯對(duì)有機(jī)相進(jìn)行一定的稀釋后進(jìn)樣檢測(cè)。以類似物石竹烯作為標(biāo)準(zhǔn)品采用選擇離子掃描模式(204、189離子)進(jìn)行GC-MS分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 表達(dá)異源MEP途徑基因模塊對(duì)E.coli合成紫槐二烯的影響

已有的研究表明dxs和idi基因是E.coli MEP途徑中最關(guān)鍵的限速基因[8-9]。強(qiáng)化dxs和idi基因的表達(dá)能夠有效地提高M(jìn)EP途徑的代謝通量[8-9]，強(qiáng)化下游萜類化合物的合成。從圖2可以看到，單獨(dú)過表達(dá)E.coli內(nèi)源dxs和idi基因的菌株經(jīng)5 d的搖瓶發(fā)酵后，紫槐二烯的產(chǎn)量分別為10.756 mg/L和9.552 mg/L，相比于對(duì)照菌株(6.552 mg/L)，分別提高了64%和46%。該結(jié)果表明在BL21(DE3)菌株中強(qiáng)化E.coli內(nèi)源MEP途徑基因?qū)μ岣遖morphadiene的合成是比較有限?？紤]到自然界中MEP途徑基因在酶活及調(diào)控特性方面的多樣性[22-23]，本研究組在前期的研究中挖掘了鏈霉菌屬、糖多孢菌屬、芽胞桿菌屬、歐文氏菌屬等不同來源的MEP途徑基因，發(fā)現(xiàn)通過表達(dá)S.avermitilis的dxs2基因和B.subtilis的二型idi基因能夠顯著地提升MEP途徑前體供應(yīng)，增加紫槐二烯的產(chǎn)量。由圖2B可知，在M9培養(yǎng)基中搖瓶發(fā)酵5 d后，單獨(dú)過表達(dá)dxs2_SAV(BL21(DE3) pJF567/pJF23)和idi_BS(BL21(DE3) pJF554/pJF23)基因能夠使紫槐二烯的產(chǎn)量達(dá)到24.91 mg/L和53.50 mg/L，分別比對(duì)照菌BL21(DE3)pET21d/pJF23提高了3.8和8.2倍。此外，引入dxs2_SAV比過表達(dá)內(nèi)源dxs_EC提高了2.3倍，引入idi_BS比過表達(dá)idi_EC提高了5.6倍。隨后構(gòu)建了T7 Prom-dxs2_SAV-idi_BS-T7 Term操縱子(pJF678)共表達(dá)dxs2_SAV和idi_BS模塊進(jìn)一步提高紫槐二烯的合成，菌株BL21(DE3)pJF678/pJF23能夠合成80.22 mg/L的紫槐二烯，比野生菌提高了12.2倍。這些結(jié)果表明引入某些外源MEP途徑基因比強(qiáng)化內(nèi)源基因能更顯著地釋放MEP途徑的潛力。外源MEP途徑基因?yàn)镋.coli MEP途徑重新設(shè)計(jì)和改造提供了豐富的元件。

2.2 補(bǔ)料分批高密度發(fā)酵過程的建立

為了考察菌株BL21(DE3)pJF678/pJF23在發(fā)酵過程中的代謝潛能，本研究先建立了紫槐二烯的高密度發(fā)酵過程(過程1)，考察了整個(gè)發(fā)酵過程中OUR、CER、菌體生長(zhǎng)、紫槐二烯產(chǎn)量、殘?zhí)菨舛群鸵宜釢舛葼顩r。為了減少發(fā)酵過程副產(chǎn)物乙酸的積累，在保證對(duì)數(shù)期快速生長(zhǎng)的前提下，整個(gè)發(fā)酵過程糖流加速率控制在較低的水平(圖1，穩(wěn)定期為6.05 g/h)，以使對(duì)數(shù)期和穩(wěn)定期的DO分別維持在20%?30%和60%?70%。由圖3可知對(duì)數(shù)期菌體生長(zhǎng)非常迅速，約24 h后OD600達(dá)到200以上，OUR和CER分別達(dá)到了192.09mmol/(L·h)和196.09 mmol/(L·h)。隨后進(jìn)入穩(wěn)定期，補(bǔ)糖速率維持在6.05 g/h，菌體仍保持微弱的生長(zhǎng)，OD600緩慢增長(zhǎng)到225左右(60 h)，OUR和CER逐漸減小，36 h以后維持在60?70 mmol/(L·h)。在對(duì)數(shù)期后期，產(chǎn)物已開始合成，尤其是在24?72 h，產(chǎn)物迅速積累。直到84 h，紫槐二烯的產(chǎn)量達(dá)到最大，為2.50 g/L。質(zhì)粒穩(wěn)定性測(cè)試發(fā)現(xiàn)120 h時(shí)雙質(zhì)粒的穩(wěn)定性維持在78%以上，因此質(zhì)粒穩(wěn)定性對(duì)后期產(chǎn)物合成減慢不會(huì)產(chǎn)生影響。整個(gè)發(fā)酵過程中殘?zhí)呛鸵宜釢舛瓤刂圃诤艿退?，僅有對(duì)數(shù)期后期和穩(wěn)定期后期有少量的殘?zhí)?1.32 g/L)和乙酸積累(46.78 mg/L)，不會(huì)對(duì)菌體產(chǎn)生抑制作用。以上結(jié)果表明發(fā)酵過程中工程菌株能夠穩(wěn)定的存在，發(fā)酵24?72 h是產(chǎn)物合成的關(guān)鍵時(shí)期。因此對(duì)穩(wěn)定期控制策略的調(diào)整對(duì)于強(qiáng)化產(chǎn)物的合成可能具有重要的作用。

圖2 產(chǎn)萜類大腸桿菌工程菌的構(gòu)建及紫槐二烯的合成Fig.2 Construction of recombinant E.coli strain for isoprenoid production and biosynthesis of amorphadiene.(A) Strategy for the construction of engineered strains and the maps of plasmids responsible for MEP pathway engineering(pJF678)and amorphadiene pathway assembly(pJF23).(B)Amorphadiene yield for engineered strains.

圖3 產(chǎn)萜類大腸桿菌工程菌補(bǔ)料分批發(fā)酵過程參數(shù)曲線Fig.3Process parameters of an E.coli feed-batch fermentation process for isoprenoid production.(A)The variation of DO,OUR and CER.(B)The variation of OD600,amorphadiene yield,acetate concentration and residual glucose.

2.3 穩(wěn)定期補(bǔ)糖控制對(duì)紫槐二烯合成的影響

從過程1可以發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定期的24?72 h是紫槐二烯快速合成的關(guān)鍵時(shí)期，于是我們希望通過調(diào)整穩(wěn)定期的補(bǔ)糖速率來強(qiáng)化產(chǎn)物合成速率和延長(zhǎng)產(chǎn)物合成期來增加紫槐二烯的產(chǎn)量?？紤]到過程1穩(wěn)定期糖流加速率(6.05 g/h)較低，本研究以此為基礎(chǔ)，在維持對(duì)數(shù)期補(bǔ)糖不變的情況下，通過逐步增加穩(wěn)定期糖流加速率來考察菌體生長(zhǎng)代謝和產(chǎn)物合成的變化。過程2(9.152 g/h)和過程3(14.08 g/h)穩(wěn)定期菌體OD600緩慢增加到270左右，OUR分別維持在約90?100 mmol/h和120?130 mmol/h，DO則分別恒定在40%?50%和25%?35%。過程4(19.52 g/h)糖流加速率最大，OD600與過程1相當(dāng)，維持在230左右，OUR從24 h的198.24 mmol/(L·h)逐漸下降到120 h的30.76 mmol/(L·h)，同時(shí)伴隨著DO逐步上升。比較4個(gè)過程的產(chǎn)物的積累情況可以發(fā)現(xiàn)(圖4D)，過程2–4與過程1一樣，產(chǎn)物均在24?72 h快速合成，最終過程2獲得了最高的紫槐二烯產(chǎn)量，發(fā)酵72 h后達(dá)到了4.85 g/L，比過程1提高了94%。60 h左右，過程3的產(chǎn)物合成速度與過程2相比，開始變慢，這可能是過程3的副產(chǎn)物乙酸積累比過程2更快引起的。過程4的補(bǔ)糖速率達(dá)到19.52 g/h，進(jìn)入穩(wěn)定期后乙酸馬上即開始快速積累，48 h時(shí)即達(dá)到2.73 g/L，嚴(yán)重地影響了發(fā)酵過程菌體的生長(zhǎng)和產(chǎn)物的積累。從質(zhì)粒穩(wěn)定性的測(cè)試發(fā)現(xiàn)過程2和過程3的質(zhì)粒穩(wěn)定性與過程1相似，120 h時(shí)仍維持在70%，過程4丟失比較嚴(yán)重，120 h僅為18%左右。以上結(jié)果表明，通過產(chǎn)物合成關(guān)鍵期補(bǔ)糖速率的調(diào)整，可以顯著地增加產(chǎn)物合成速率，增加紫槐二烯的產(chǎn)量，但無法延長(zhǎng)產(chǎn)物合成周期。

2.4 控制對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期補(bǔ)糖對(duì)菌體生長(zhǎng)及紫槐二烯合成的影響

從2.3的結(jié)果穩(wěn)定期補(bǔ)糖速率調(diào)整雖然可以改變24?72 h產(chǎn)物合成的速率，無法進(jìn)一步延長(zhǎng)產(chǎn)物的積累時(shí)間。考慮到萜類合成需要MEP途徑提供DMAPP和IPP前體以及大量的ATP、還原力，而無論MEP途徑活性和ATP、還原力均與菌體生長(zhǎng)息息相關(guān)。穩(wěn)定期中前期的24?72 h，菌體代謝活力較旺盛，能提供較多的能量和輔因子，同時(shí)MEP途徑活性維持在較高的水平，因此工程菌株可以維持較活躍的異源代謝。基于這個(gè)推測(cè)，本研究進(jìn)一步調(diào)整了對(duì)數(shù)期糖流加速率，希望通過延長(zhǎng)菌體生長(zhǎng)周期，達(dá)到延長(zhǎng)產(chǎn)物合成時(shí)間，來增加紫槐二烯的最終產(chǎn)量。因此，在維持穩(wěn)定期補(bǔ)糖為9.152 g/h的情況下，調(diào)整了對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的糖流加速率(圖1A，過程5)，使對(duì)數(shù)期DO維持在40%?50%左右(圖5A)。由圖5B可以看到，OD600值在約48 h時(shí)才達(dá)到200，隨后進(jìn)入穩(wěn)定期恒速補(bǔ)糖階段。在48?108 h菌體濃度緩慢增加直到約108 h，OD600達(dá)到最大值為258.64。紫槐二烯的產(chǎn)量也一直保持增長(zhǎng)，直到約108 h達(dá)到最大值為6.1 g/L，在過程2的基礎(chǔ)上又提高了25.7%。該結(jié)果表明通過適當(dāng)?shù)販p慢菌體生長(zhǎng)，可以使菌體調(diào)節(jié)到更有利于異源萜類代謝產(chǎn)物合成的生理狀態(tài)。

圖4 穩(wěn)定期補(bǔ)糖速率優(yōu)化的影響Fig.4Effects of glucose feeding rate optimization during stationary phase.(A)The DO variation of process 1–4. (B)The acetate accumulation of process 1–4.(C)The OD600variation of process 1–4.(D)The amorphadiene accumulation of process 1–4.

圖5 對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期糖流加速率調(diào)整對(duì)產(chǎn)萜類大腸桿菌補(bǔ)料分批發(fā)酵的影響Fig.5Effects of glucose feeding rate during stationary phase to a feed-batch fermentation process.(A)The variation of DO,OUR and CER.(B)The variation of OD600,amorphadiene yield,acetate concentration and residual glucose.

3 討論

隨著菌株及下游途徑產(chǎn)物的變化，MEP途徑關(guān)鍵基因強(qiáng)化對(duì)萜類合成的影響是不同[12,14-15]。Yuan等[12]在菌株MC1061中強(qiáng)化了染色體上dxs和idi的表達(dá)，使β-胡蘿卜素的產(chǎn)量提高幅度達(dá)到2倍和1.4倍。Zhao等[14]在BL21(DE3)中過表達(dá)dxs，使異戊二烯產(chǎn)量提高幅度僅為50%。Morrone等[15]在C41 Overexpress菌株中過表達(dá)dxs和idi后使松香二烯的產(chǎn)量分別降低了50%和提高了50%。這些研究不僅表明MEP途徑關(guān)鍵基因的強(qiáng)化對(duì)提高不同下游萜類產(chǎn)物的合成是不同的，而且也說明了簡(jiǎn)單強(qiáng)化內(nèi)源MEP途徑基因表達(dá)的策略對(duì)提高萜類的合成是相對(duì)有限的。在過去的十多年里，多種外源的MEP途徑基因已經(jīng)被用于E.coli MEP途徑的強(qiáng)化，并更有效地改善了異戊二烯和番茄紅素等萜類化合物的合成[22-24]。這些研究預(yù)示著不同來源的MEP途徑基因可以為E.coli內(nèi)源MEP途徑的改造提供豐富的元件。隨著大量微生物基因組信息的積累，鏈霉菌等原核生物被發(fā)現(xiàn)含有非常多樣的MEP途徑基因元件[25]，如S.avermitilis和B.subtilis自身均以MEP途徑作為萜類前體途徑合成geosmin[25]和異戊二烯[26]等次級(jí)代謝產(chǎn)物。本實(shí)驗(yàn)室在前期的研究中通過對(duì)鏈霉菌屬、糖多孢菌屬、芽胞桿菌屬和歐文氏菌屬M(fèi)EP途徑模塊的挖掘，idi基因發(fā)現(xiàn)dxs2_SAV和idi_BS這兩個(gè)MEP途徑基因能夠非常顯著地改善E.coli MEP途徑的活性?；诖?，本研究共表達(dá)dxs2_SAV和idi_BS兩個(gè)外源MEP途徑基因模塊，使工程菌在搖瓶中紫槐二烯的產(chǎn)量比野生菌提高了12.2倍，有效地釋放MEP途徑的巨大潛力?；蚪M信息分析發(fā)現(xiàn)S.avermitilis中存在著dxs1和dxs2兩個(gè)不同的dxs基因。在工程菌中表達(dá)了dxs2_SAV基因，能夠比強(qiáng)化E.coli自身dxs基因更明顯地提高萜類的合成，而表達(dá)dxs1_SAV對(duì)紫槐二烯的合成沒有影響(未提供數(shù)據(jù))。這說明S.avermitilis的dxs1和dxs2基因與M.tuberculosis的dxs1和dxs2一樣，具有完全不同的酶活與調(diào)控特性[23]。B.subtilis的IDI酶是典型的二型IDI酶。單獨(dú)過表達(dá)idi_BS能夠使紫槐二烯合成提高8.2倍，該發(fā)現(xiàn)與已報(bào)道的某些II型IDI酶比I型IDI酶更能釋放MEP途徑活性一致[24]。該研究也證明了豐富的異源MEP途徑基因資源是MEP途徑潛力挖掘的重要模塊。

基于傳統(tǒng)蛋白表達(dá)的E.coli高密度發(fā)酵方法[18]，本研究首先建立了簡(jiǎn)單的補(bǔ)料分批培養(yǎng)過程，發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定期的24–72 h是紫槐二烯積累的關(guān)鍵時(shí)期。對(duì)發(fā)酵過程穩(wěn)定期糖流加速率進(jìn)行優(yōu)化調(diào)控后，紫槐二烯產(chǎn)量提高了94%。無論是化合物異源合成還是蛋白表達(dá)高密度培養(yǎng)過程，葡萄糖作為唯一碳源，為菌體生長(zhǎng)維持和產(chǎn)物的合成提供必要的物質(zhì)基礎(chǔ)和ATP、NADPH等能量與輔因子。但異源合成與蛋白表達(dá)在基因表達(dá)、生理代謝兩個(gè)層次上存在很大差異。蛋白表達(dá)往往需要將盡可能多的物質(zhì)和能量導(dǎo)向蛋白質(zhì)合成代謝以使蛋白質(zhì)合成最大化，而異源合成需要實(shí)現(xiàn)前體及下游途徑基因的適量表達(dá)，以平衡物質(zhì)和能量代謝流的平衡，盡可能多地導(dǎo)向目的產(chǎn)物的合成[28]。因此與蛋白表達(dá)一樣[29]，建立適合異源合成工程菌的糖流加工藝對(duì)產(chǎn)物合成具有顯著的影響。在過程1和過程2中的糖流加速率下，沒有明顯的副產(chǎn)物乙酸積累，過程2比過程1具有更大糖耗和代謝流以支持產(chǎn)物合成。繼續(xù)增大補(bǔ)糖后，過程3中60 h后乙酸積累增加，影響了產(chǎn)物的合成，而過程4中，由于補(bǔ)糖速率過大，菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)物合成受到明顯抑制。因此通過產(chǎn)物合成期的糖流加速率的優(yōu)化可以找到平衡工程菌物質(zhì)和能量代謝之間、自身生長(zhǎng)維持與異源代謝之間的控制點(diǎn)，從反應(yīng)器水平最大限制度發(fā)揮工程菌的潛力。此外穩(wěn)定期補(bǔ)糖速率的調(diào)整無法延長(zhǎng)產(chǎn)物快速積累的周期。而通過調(diào)整對(duì)數(shù)期的補(bǔ)糖速率來延長(zhǎng)菌體生長(zhǎng)周期的策略，可以有效地延長(zhǎng)產(chǎn)物的積累。這可能是因?yàn)楫?dāng)前期菌體快速生長(zhǎng)時(shí)，發(fā)酵到72 h時(shí)菌體已開始老化，而MEP途徑是與菌體生長(zhǎng)密切相關(guān)，菌體老化導(dǎo)致細(xì)胞維持代謝消耗增加，進(jìn)入MEP途徑的代謝流量減少，從而影響工程菌萜類前體的供應(yīng)。延長(zhǎng)菌體的生長(zhǎng)周期，可以較長(zhǎng)時(shí)間地保持菌體代謝活力和萜類前體的供應(yīng)，增加紫槐二烯的產(chǎn)量。

REFERENCES

[1]Yadav VG,De Mey M,Lim CG,et al.The future of metabolic engineering and synthetic biology: towards a systematic practice.Metab Eng,2012, 14(3):233–241.

[2]Lee JW,Na D,Park JM,et al.Systems metabolic engineering of microorganisms for natural and non-natural chemicals.Nat Chem Biol,2012,8(6): 536–546.

[3]Keasling JD.Manufacturing molecules through metabolic engineering.Science,2010,330(6009): 1355–1358.

[4]Immethun CM,Hoynes-O'Connor AG,Balassy A,et al.Microbial production of isoprenoids enabled by synthetic biology.Front Microbiol, 2013,4(75):1–8.

[5]Ro DK,Paradise EM,Ouellet M,et al.Production of the antimalarial drug precursor artemisinic acid in engineered yeast.Nature,2006,440(7086): 940–943.

[6]Tsuruta H,Paddon CJ,Eng D,et al.High-level production of amorpha-4,11-diene,a precursor of the antimalarial agent artemisinin,in Escherichia coli.PLoS ONE,2009,4(2):e4489.

[7]Rodriguez-Concepcion M,Boronat A.Elucidation of the methylerythritol phosphate pathway for isoprenoid biosynthesis in bacteria and plastids.A metabolic milestone achieved through genomics. Plant Physiol,2002,130(3):1079–1089.

[8]Ajikumar PK,Xiao WH,Tyo KE,et al.Isoprenoid pathwayoptimizationforTaxolprecursor overproduction in Escherichia coli.Science,2010, 330(6000):70–74.

[9]Zhao J,Li Q,Sun T,et al.Engineering centralmetabolicmodulesofEscherichiacolifor improvingβ-caroteneproduction.MetabEng, 2013,17(0):42–50.

[10]PartowS,SiewersV,DavietL,etal. Reconstruction and evaluation of the synthetic bacterialMEPpathwayinSaccharomyces cerevisiae.PLoS ONE,2012,7(12):e52498.

[11]Meng H,Wang Y,Hua Q,et al.In silico analysis andexperimentalimprovementoftaxadiene heterologousbiosynthesisinEscherichiacoli. Biotechnol Bioproc E,2011,16(2):205–215.

[12]MorroneD,LowryL,DetermanMK,etal. Increasingditerpeneyieldwithamodular metabolicengineeringsysteminE.coli: comparison of MEV and MEP isoprenoid precursor pathway engineering.Appl Microbiol Biotechnol, 2010,85(6):1893–1906.

[13]MartinVJ,PiteraDJ,WithersST,etal. Engineering a mevalonate pathway in Escherichia coli for production of terpenoids.Nat Biotechnol, 2003,21(7):796–802.

[14]Zhao Y,Yang J,Qin B,et al.Biosynthesis of isoprene in Escherichia coli via methylerythritol phosphate(MEP)pathway.ApplMicrobiol Biotechnol,2011,90(6):1915–1922.

[15]YuanLZ,RouvièrePE,LaRossaRA,etal. Chromosomalpromoterreplacementofthe isoprenoidpathwayforenhancingcarotenoid production in E.coli.Metabolic Engin,2006,8(1): 79–90.

[16]AlperH,MiyaokuK,StephanopoulosG. Characterization of lycopene-overproducing E.coli strains in high cell density fermentations.Appl Microbiol Biotechnol,2006,72(5):968–974.

[17]NewmanJD,MarshallJ,ChangM,etal. High-level production of amorpha-4,11-diene in a two-phase partitioning bioreactor of metabolically engineered Escherichia coli.Biotechnol Bioeng, 2006,95(4):684–691.

[18]Lee SY.High cell-density culture of Escherichia coli.Trends Biotechnol,1996,14(3):98–105.

[19]Meng H,Wang J,Xiong Z,et al.Quantitative designofregulatoryelementsbasedon high-precision strength prediction using artificial neural network.PLoS ONE,2013,8(4):e60288.

[20]Miller GL.Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar.Analyt Chem, 1959,31(3):426–428.

[21]LiBQ,DengYJ,YangJW.Determining concentrationofammoniumioninexternal environmentofblankliposomeby phenol-hypochlorite reaction.Chin J Pharm,2006, 4(4):181–185(in Chinese).李寶齊,鄧英杰,楊靜文.苯酚-次氯酸鹽法測(cè)定空白脂質(zhì)體透析液中銨離子濃度.中國(guó)藥劑學(xué)雜志,2006,4(4):181–185.

[22]BerthelotK,EstevezY,DeffieuxA,etal. Isopentenyl diphosphate isomerase:A checkpoint to isoprenoid biosynthesis.Biochimie,2012,94(8): 1621–1634.

[23]BrownAC,EberlM,CrickDC,etal.The nonmevalonate pathway of isoprenoid biosynthesis in Mycobacterium tuberculosis is essential and transcriptionally regulated by dxs.J Bacteriol, 2010,192(9):2424–2433.

[24]Kajiwara S,Fraser PD,Kondo K,et al.Expression of an exogenous isopentenyl diphosphate isomerase geneenhancesisoprenoidbiosynthesisin Escherichia coli.Biochem J,1997,324(Pt 2): 421–426.

[25]Rad SA,Zahiri HS,Noghabi KA,et al.Type 2 IDI performs better than type 1 for improving lycopene production in metabolically engineered E.coli strains.World J Microb Biotechnol,2012,28(1): 313–321.

[26]Cane DE,He X,Kobayashi S,et al.Geosmin biosynthesis in Streptomyces avermitilis.Molecular cloning,expression,and mechanistic study of the germacradienol/geosmin synthase.J Antibiot,2006, 59(8):471–479.

[27]WagnerWP,HelmigD,FallR.Isoprene biosynthesisinBacillussubtilisviathe methylerythritol phosphate pathway.J Nat Prod, 2000,63(1):37–40.

[28]NaD,KimTY,LeeSY.Constructionand optimization of synthetic pathways in metabolic engineering.Curr Opion Microbiol,2010,13(3): 363–370.

[29]LiX,TaylorKB.Effectofglucoseonthe expression parameters of recombinant protein in Escherichia coli during batch growth in complex medium.Biotechnol Prog,1994,10(2):160–164.

(本文責(zé)編陳宏宇)

Engineering MEP pathway in Escherichia coli for amorphadiene production and optimizing the bioprocess through glucose feeding control

Jianfeng Wang1,2,Zhiqiang Xiong2,Siliang Zhang1,and Yong Wang2
1 State Key Laboratory of Bioreactor Engineering,East China University of Science and Technology,Shanghai 200237,China 2 Institute of Plant Physiology and Ecology,Shanghai Institutes for Biological Sciences,Chinese Academy of Sciences,Shanghai 200032, China

The pathway of 2-methyl-D-erythritol-4-phosphate(MEP)is the exclusive isoprenoid precursor biosynthetic pathway in Escherichia coli,with a higher theoretical yield than mevalonate(MVA)pathway.However,due to lack of information about the regulation of MEP pathway,only engineering MEP pathway in E.coli achieved limited improvement of heterologous isoprenoid production.We used exogenous MEP pathway genes to improve MEP pathway in E.coli and optimized the glucose feeding to release the potential of MEP pathway.The results demonstrate that co-expression of dxs2 from Streptomyces avermitilis and idi from Bacillus subtilis can increase amorphadiene production with 12.2-fold compared with the wild-type strain in shake flask fermentation.Then we established a high-cell density fermentation process for the engineered strain,and found that the phase from 24 to 72 h is important for product biosynthesis.The optimization of glucose feeding rate during 24 to 72 h significantly improved product accumulation,which was improved from 2.5 to 4.85 g/L,within the same process time.Considering the attenuation of strain metabolism after 72 h,this study further modulated the glucose feeding rate during exponential phase to control strain growth and the amorphadiene yield eventually reached to 6.1 g/L.These results provided useful information to develop engineered E.coli for isoprenoid production through MEP pathway engineering.

2-methyl-D-erythritol-4-phosphate pathway(MEP pathway),isoprenoids,Escherichia coli,high-cell density fermentation,glucose feeding rate

September 30,2013;Accepted:November 29,2013

Siliang Zhang.Tel/Fax:+86-21-64252565;E-mail:siliangz@ecust.edu.cn Yong Wang.Tel/Fax:+86-21-54924295;E-mail:yongwang@sibs.ac.cn

Supported by:National Basic Research Program of China(973 Program)(No.2012CB721104),National High Technology Research and Development Program(863Program)(No.2012AA02A701),National Natural Science Foundation of China(Nos.31170101,31100073), Major Projects of Knowledge Innovation Program of Chinese Academy of Sciences(No.KSCX2-EW-J-12).

國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃(973計(jì)劃)(No.2012CB721104)，國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃(863計(jì)劃)(No.2012AA02A701)，國(guó)家自然科學(xué)基金(Nos. 31170101, 31100073)，中國(guó)科學(xué)院知識(shí)創(chuàng)新工程重大項(xiàng)目(No. KSCX2-EW-J-12) 資助。