粗糙脈孢菌纖維素酶液體發(fā)酵優(yōu)良形態(tài)突變體篩選

孫志勇，林良才，王敏，田朝光

1天津科技大學生物工程學院，天津 300457

2中國科學院天津工業(yè)生物技術研究所 系統(tǒng)微生物工程重點實驗室，天津 300308

粗糙脈孢菌纖維素酶液體發(fā)酵優(yōu)良形態(tài)突變體篩選

孫志勇1,2，林良才2，王敏1，田朝光2

1天津科技大學生物工程學院，天津 300457

2中國科學院天津工業(yè)生物技術研究所 系統(tǒng)微生物工程重點實驗室，天津 300308

孫志勇, 林良才, 王敏, 等. 粗糙脈孢菌纖維素酶液體發(fā)酵優(yōu)良形態(tài)突變體篩選. 生物工程學報, 2014, 30(1): 55?63.

Sun ZY, Lin LC, Wang M, et al. Improving cellulases production with Neurospora crassa by morphology mutants screening. Chin J Biotech, 2014, 30(1): 55?63.

絲狀真菌被廣泛地用于包括纖維素酶在內(nèi)的工業(yè)酶生產(chǎn)過程。在液體深層發(fā)酵中，絲狀真菌菌絲形態(tài)直接影響發(fā)酵液的流變特性，進而與目標酶蛋白產(chǎn)量存在著重要的關聯(lián)。目前，針對絲狀真菌工業(yè)酶液體發(fā)酵菌絲形態(tài)的研究依然是從傳統(tǒng)的發(fā)酵工程學角度出發(fā)，對與發(fā)酵水平緊密相關的形態(tài)、粘度等性狀相關基因的認識遠遠不夠。為了挖掘深層發(fā)酵中對絲狀真菌發(fā)酵產(chǎn)酶性能具有重要影響的形態(tài)發(fā)育相關基因，以粗糙脈孢菌Neurospora crassa單基因突變體庫中的95株形態(tài)突變株為研究對象，在結(jié)晶纖維素為碳源的條件下進行篩選，探尋與野生型菌株蛋白產(chǎn)量有顯著差異的突變株。同時，對這些突變株的內(nèi)切-β-1,4-葡聚糖酶酶活、β-葡萄糖苷酶酶活、發(fā)酵液粘度和菌絲干重進行了測定，并觀察了發(fā)酵液中突變株的菌絲形態(tài)。實驗結(jié)果表明，與野生型菌株相比，突變株SZY32、SZY35、SZY39和SZY43發(fā)酵液中蛋白濃度顯著降低，突變株SZY11、SZY63、SZY69和SZY87發(fā)酵液中蛋白濃度顯著性提高。值得注意的是，突變株SZY11和SZY43發(fā)酵液菌絲體主要形態(tài)為菌球狀，其發(fā)酵液粘度分別降低75%和50%，突變株SZY87在發(fā)酵液中呈長絲狀，發(fā)酵液粘度顯著升高至少2倍。這些與產(chǎn)酶水平相關的形態(tài)、粘度基因的獲得將有助于絲狀真菌纖維素酶等工業(yè)酶高產(chǎn)工程菌株的理性構(gòu)建。

粗糙脈孢菌，菌絲形態(tài)，發(fā)酵液粘度，纖維素酶

絲狀真菌是包括纖維素酶在內(nèi)的傳統(tǒng)發(fā)酵工業(yè)的主要生產(chǎn)者，與細菌和酵母相比，在翻譯后修飾、分泌能力、代謝產(chǎn)物多樣性和生產(chǎn)能力等方面具有顯著優(yōu)勢，被廣泛用于生產(chǎn)各種代謝物、生物活性物質(zhì)和工業(yè)酶等，涉及醫(yī)藥、食品等多個行業(yè)[1-4]。液體深層發(fā)酵過程中，絲狀真菌菌絲形態(tài)對其目標產(chǎn)品的合成代謝及產(chǎn)量有顯著影響。通常情況下，絲狀真菌菌絲形態(tài)分為2種形式：絲狀 (Mycelial form) 和球形 (Pelleted form)[5-6]。絲狀又分為松散的菌絲聚集體(Clump) 和菌絲體 (Mycelium)。菌體形態(tài)以絲狀為主會造成菌絲間相互纏繞，增大發(fā)酵液粘度，不利于營養(yǎng)物質(zhì)和氧的溶解、傳遞，甚至使發(fā)酵體系達到氣溶膠狀態(tài)，產(chǎn)率明顯降低[4,7-8]。若菌絲體形成細小菌絲顆粒，則料液傳質(zhì)效果較好，動力輸入減小，生產(chǎn)成本降低。然而，菌球顆粒太大或太致密會阻礙氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)的傳遞，導致內(nèi)部處于缺氧及營養(yǎng)匱乏的狀態(tài)，影響菌體生長和產(chǎn)物合成[9-11]。因此，如何優(yōu)化控制絲狀真菌發(fā)酵過程中的菌絲體形態(tài)成為現(xiàn)代工業(yè)發(fā)酵調(diào)控的熱點與難點。

在里氏木霉Trichoderma reesei和黑曲霉Aspergillus niger等工業(yè)菌株發(fā)酵生產(chǎn)中，常常出現(xiàn)發(fā)酵液流變性差、營養(yǎng)物質(zhì)傳遞不均勻和溶氧困難等問題，進而發(fā)生高能耗、低產(chǎn)率的情況。在絲狀真菌工業(yè)發(fā)酵過程中，發(fā)酵液的流變性能主要取決于單位體積的菌體生物量和菌絲體形態(tài)[12]。目前，國內(nèi)外研究者對于絲狀真菌菌體形態(tài)的控制主要是從傳統(tǒng)的發(fā)酵工程學角度出發(fā)，如菌種特性、接種量、培養(yǎng)基成分、溫度、攪拌轉(zhuǎn)速、pH、發(fā)酵罐的大小和類型等[4,7,10]。此外，誘變育種也被用于菌絲形態(tài)的研究，如Bocking等將米曲霉Aspergillus oryzae通過亞硝酸和紫外誘變，得到5株多分支突變株并且搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基消耗速率加快，發(fā)酵液流變學性能明顯改善，其扭矩值降低50%以上，蛋白產(chǎn)量顯著提高[13]。至于模式真菌粗糙脈孢菌Neurospora crassa單基因敲除突變株，研究者多是從其生理性狀入手，如Ziv等通過固體平板觀察其菌絲長度、分支和產(chǎn)孢情況，并對突變基因做互補和蛋白定位等分析工作，發(fā)現(xiàn)COT1可通過磷酸化水平的調(diào)控來控制菌絲的延伸和分支[14]。Watters等在無機鹽固體培養(yǎng)基上利用33 ℃和10 ℃兩個溫度條件培養(yǎng)N. crassa單基因敲除突變株，探索突變株生長速率與分支度間的關系[15]。少數(shù)研究者也利用突變株發(fā)酵產(chǎn)酶。Lee等利用溫度敏感型突變株mcb在以1.0%蔗糖和0.5%羧甲基纖維素為碳源的條件下?lián)u瓶培養(yǎng)4 d，發(fā)現(xiàn)蛋白產(chǎn)量和內(nèi)切-β-1,4-葡聚糖酶活力均比野生型菌株有明顯提高[16]。然而，對發(fā)酵產(chǎn)酶過程中蛋白水平和粘度等發(fā)酵性狀相關功能基因的克隆鑒定卻鮮有報道。

本文以N. crassa野生型菌株FGSC2489為對照，將95株形態(tài)突變體在以結(jié)晶纖維素為碳源的培養(yǎng)基中進行篩選，通過測定發(fā)酵液蛋白濃度、酶活活力和發(fā)酵液粘度等發(fā)酵性狀，同時觀察發(fā)酵液菌絲體形態(tài)，篩選獲得8株蛋白濃度顯著變化的突變株，其中5株突變株的發(fā)酵液粘度明顯改變，并對這些菌株突變基因的功能進行了簡述。這些功能基因的獲得，加深了對絲狀真菌菌絲形態(tài)變化分子機理層次的認識，為進一步闡述絲狀真菌優(yōu)良發(fā)酵性狀的分子基礎以及基因組水平的菌種改良奠定了基礎，以期達到提高纖維素酶發(fā)酵水平的目的。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

N. crassa野生型菌株FGSC 2489、N. crassa形態(tài)突變體和潛在形態(tài)突變體均購自美國真菌遺傳保藏中心 (Fungal Genetics Stock Center，F(xiàn)GSC)。菌種保藏采用冷凍甘油管法。

1.1.2 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基(L)：1% Vogel’s salts，20 g蔗糖，15 g瓊脂粉，自然pH。

產(chǎn)酶培養(yǎng)基(L)：1% Vogel’s salts，20 g結(jié)晶纖維素，7.5 g酵母粉，2 mL吐溫80。

Vogel’s salts medium(L)：125 g C6H5Na3O7，250 g KH2PO4，100 g NH4NO3，10 g MgSO4·7H2O，5 g CaCl2·2H2O，5 mL微量元素溶液，2.5 mL 0.1 mg/mL生物素溶液。

微量元素溶液 (L)：50 g C6H8O7·H2O，50 g ZnSO4·7H2O，10 g Fe(NH4)(SO)2·6H2O，2.5 g CuSO4·5H2O，0.5 g MnSO4·H2O，0.5 g H3BO3，0.5 g Na2MoO4·2H2O。

1.1.3 主要試劑

Brad-ford試劑購自BIO-RAD公司；AZO-CM-CELLULOSE試劑購自Megazyme公司；對硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷p-NPG和其他化學試劑均購自Sigma公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 突變體篩選方法

根據(jù)N. crassa野生型菌株FGSC2489搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)結(jié)果，突變體篩選時孢子終濃度為105/mL。產(chǎn)酶培養(yǎng)基裝液量為100 mL培養(yǎng)基/ 250 mL三角瓶，pH 6.5。25 ℃搖床200 r/min光照培養(yǎng)7 d。

1.2.2 發(fā)酵液蛋白濃度的測定

發(fā)酵上清液蛋白濃度采用Bradford法測定，以牛血清白蛋白作為標準。試驗重復3次，取平均值。

1.2.3 酶活測定

1) 內(nèi)切-β-1,4-葡聚糖酶活力的測定方法：將發(fā)酵上清液用0.1 mol/L醋酸鈉緩沖液 (pH 4.6) 稀釋適宜倍數(shù)，取終體積為0.5 mL，40 ℃水浴鍋預熱5 min，取出，加入0.5 mL Megazyme AZO-CM-CELLULOSE底物溶液，混勻，40 ℃溫育10 min，加入2.5 mL沉淀劑終止反應，室溫靜置10 min，混勻，1 000×g離心10 min，測OD590值?？瞻捉M使用滅活酶液作對照。每個樣品做3個平行對照。

根據(jù)下列公式計算內(nèi)切-β-1,4-葡聚糖酶活力(U/mL)：

Units/mL =(412.5×OD590-6.0)×2×Dilution/1 000

2) β-葡萄糖苷酶活力的測定方法：取50 μL發(fā)酵上清液，加入200 μL 0.05 mol/L乙酸鈉緩沖液 (pH 4.8)，混勻，加入250 μL 1 mg/mL p-NPG底物溶液，混勻，50 ℃溫育10 min，加入500 μL 1 mol/L碳酸鈉溶液終止反應，測OD420值?？瞻捉M使用滅活酶液作對照。每個樣品做3個平行對照。

根據(jù)下列公式計算β-葡萄糖苷酶活力(U/mL)：

Units/mL =(294.1176×OD420-10) ×0.00025× 4×Dilution/(10 min)

3) 活性定義：在上述測定條件下，單位體積每分鐘水解底物產(chǎn)生1 μmol產(chǎn)物所需的酶量為1個酶活力單位。

1.2.4 發(fā)酵液菌絲形態(tài)的觀察

取10 μL發(fā)酵液滴于載玻片中央處，輕輕蓋上蓋玻片，分別使用40倍體視顯微鏡和100倍QIMAGING Retiga 2000R電子顯微鏡觀察，拍取菌絲顯微圖片。

1.2.5 發(fā)酵液粘度的測定

取9 mL搖勻的發(fā)酵液置于樣品杯中，設置Brookfield HB DV-III Ultra旋轉(zhuǎn)粘度計的轉(zhuǎn)速為40 r/min，讀取儀器運行1 min時穩(wěn)定的扭矩值，單位為%[13]。試驗重復3次，取平均值。

1.2.6 發(fā)酵液菌絲干重和纖維素水解率的測定

取10 mL發(fā)酵液，真空泵抽濾去上清液，用已稱重的錫箔紙包裹，65 ℃烘箱烘干至恒重，稱重。單位為g。每個樣品做3個平行對照，試驗重復3次。

取10 mL發(fā)酵液，在煮沸的醋酸硝酸混合液中溶解真菌菌絲體[17-18]，65 ℃烘干至恒重，稱重。按公式W (%) =(1－10×稱量的纖維素干重／2.00)×100%，計算纖維素水解率。每個樣品做3個平行對照，試驗重復3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 突變體庫的初篩

按1.2.1突變體篩選方法將95株形態(tài)突變體和潛在的形態(tài)突變體逐一篩選，與野生型菌株蛋白產(chǎn)量作比較，得到蛋白產(chǎn)量提高20%以上和下降20%以上的各4株 (圖1)。如圖2所示，突變株SZY11、SZY63、SZY69和SZY87蛋白產(chǎn)量比野生型菌株高20%以上，其中SZY69蛋白產(chǎn)量最高，約為野生型菌株的130%。突變株SZY32、SZY35、SZY39和SZY43的蛋白產(chǎn)量明顯低于野生型菌株，其中突變株SZY35的蛋白產(chǎn)量僅為野生型菌株的65%。

圖1 95株突變體蛋白含量分布圖 (野生型菌株標記為五星，X軸表示95株突變體編號)Fig. 1 The distribution of protein concentration of 95 mutants (Star means wild type, X-axis shows the number of mutants).

圖2 突變株的蛋白含量Fig. 2 Protein concentration produced by the wild type and mutants when grown on Avicel. *P ＜ 0.05，** P ＜0.01.

2.2 突變株酶活力的測定

2.2.1 內(nèi)切-β-1,4-葡聚糖酶活力的測定

將8株突變株與野生型菌株在產(chǎn)酶培養(yǎng)基中培養(yǎng)7 d，離心取上清，測定內(nèi)切-β-1,4-葡聚糖酶活力。如圖3所示，與野生型菌株相比，突變株SZY35、SZY39和SZY43酶活較低，SZY43最低，約為17 U/mL，比野生型菌株降低32%。而突變株SZY63、SZY69和SZY87酶活較高，最高可達到43 U/mL，比野生型菌株提高27%。SZY11和SZY32沒有顯著差異。

2.2.2 β-葡萄糖苷酶活力的測定

按實驗方法1.2.3中的酶活測定方法，測定β-葡萄糖苷酶活力。從圖3中看出，與野生型菌株相比，突變株SZY32、SZY39和SZY43酶活較低，其中SZY43最低，約為0.17 U/mL，比野生型菌株降低77%。SZY63酶活最高，約為1.45 U/mL，比野生型菌株提高100%。其余突變株沒有顯著變化。

結(jié)合兩個酶酶活來講，突變株SZY39和SZY43酶活均比野生型菌株低，突變株SZY63酶活均比野生型菌株有顯著提高。

圖3 突變株的內(nèi)切-β-1,4-葡聚糖酶活力和β-葡萄糖苷酶活力Fig.3 Endo-β-1,4-glucanase activities and β-glucosidase activities produced by the wild type and mutants when grown on Avicel.

2.3 發(fā)酵液菌絲形態(tài)的觀察

將8株突變株在以結(jié)晶纖維素為碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)7 d，分別使用體視顯微鏡和電子顯微鏡觀察發(fā)酵液菌絲形態(tài)。由圖4可知，野生型菌株發(fā)酵液菌絲體呈絲狀，纖維素殘留量較少。突變株SZY32、SZY35和SZY39菌絲體也呈絲狀，然而SZY35和SZY39發(fā)酵液中殘留較多的纖維素晶體，這一點與這兩株突變株低蛋白產(chǎn)量和低酶活水平的結(jié)果相符合。值得注意的是，突變株SZY11和SZY43菌絲形態(tài)呈菌球狀，SZY11發(fā)酵液中菌球數(shù)量較多，表面更光滑，結(jié)晶纖維素殘余量較少，而SZY43僅有少量菌球，表面粗糙，菌球中心致密，并包裹有較多的纖維素碎片，說明其對纖維素利用率較低，這與其發(fā)酵液蛋白水平降低和酶活下降的情況相吻合。

此外，突變株SZY63、SZY69和SZY87菌絲形態(tài)呈絲狀，其中SZY69和SZY87菌絲比野生型菌株長，尤其是SZY87，菌絲形態(tài)變化顯著(圖4)。這種菌絲形態(tài)雖然在一定程度上利于營養(yǎng)成分的傳遞，發(fā)酵上清液中蛋白含量和酶活均有所提高，但會降低發(fā)酵液流變性能，增大發(fā)酵能耗。

2.4 發(fā)酵液粘度的測量

與野生型菌株相比，8株突變株發(fā)酵液中菌絲形態(tài)差異明顯 (圖4)。而菌絲形態(tài)與發(fā)酵液流變性能有著密切聯(lián)系，且發(fā)酵液的流變性可通過發(fā)酵液粘度來衡量。如圖5所示，突變株SZY11和SZY43發(fā)酵液粘度顯著降低，分別為野生型菌株的25% 和50%。這一結(jié)果與這兩株突變株在發(fā)酵液中呈菌球狀的特征相符 (圖4) 。突變株SZY39、SZY69和SZY87發(fā)酵液粘度明顯升高，其中SZY87表現(xiàn)出較長的菌絲形態(tài)，粘度至少為野生型2倍。由此推測，絲狀真菌在液體深層發(fā)酵過程中菌絲體呈球狀，發(fā)酵液粘度值較小，具有優(yōu)良的流變性能，而絲狀菌絲體會使發(fā)酵液粘度升高，可能造成發(fā)酵條件異常，導致整個發(fā)酵失敗。發(fā)酵液粘度大、流變性能差，嚴重影響營養(yǎng)物質(zhì)的傳遞和利用，增大發(fā)酵過程中的攪拌和通氧能耗，不利于發(fā)酵工業(yè)節(jié)能減排綠色發(fā)展目標的實現(xiàn)。

圖4 突變株的發(fā)酵液菌絲形態(tài) (40倍和100倍，圖中殘留纖維素用黑框標出)Fig. 4 Micrograph of mycelial morphology of the wild type and mutants when grown on Avicel (40 fold and 100 fold, black frames represent cellulose residue).

2.5 發(fā)酵液菌絲干重

除發(fā)酵液菌絲形態(tài)的影響外，單位體積菌體干重的大小對發(fā)酵液粘度高低有著重大影響。通過測定搖瓶發(fā)酵7 d時的菌體干重，特別是蛋白產(chǎn)量明顯升高的突變株的菌體干重，尋找影響發(fā)酵液粘度性狀的真正原因。研究表明，野生型菌株纖維素水解率可達到98%，除突變株SZY35和SZY39以外，其余6株突變體纖維素水解率與野生型菌株相比，沒有顯著變化。與野生型菌株相比，突變株SZY35和SZY39發(fā)酵液中殘留較多的結(jié)晶纖維素 (圖4)，但其菌絲干重卻顯著升高，相關基因在纖維素酶表達過程中的功能有待進一步深入研究。由圖6發(fā)現(xiàn)，突變株SZY63菌絲干重顯著下降，比野生型菌株減少約30%。突變株SZY11和SZY43菌絲干重與野生型菌株相比沒有顯著性差異，但其發(fā)酵液粘度卻顯著降低，說明其菌絲形態(tài)的變化引起發(fā)酵液粘度的降低。

圖5 突變株的發(fā)酵液粘度Fig. 5 Viscosity of the wild type and mutants when grown on Avicel. *P ＜ 0.05，** P ＜ 0.01.

圖6 突變株的菌絲干重和結(jié)晶纖維素的水解率Fig. 6 Mycelial dry weight and hydrolysis rate of Avicel cellulose of the wild type and mutants when grown on Avicel.

3 討論

N. crassa作為一種模式真核生物，其全基因組測序工作早在2003年已經(jīng)完成[19]，并被廣泛用于遺傳學、生物化學和分子生物學研究，已積累了大量的研究資源。Colot等于2006年構(gòu)建了N. crassa單基因敲除突變體庫[20]，該突變體庫是目前為止絲狀真菌中基因覆蓋率最大的一個突變體庫，這使得在液體深層發(fā)酵過程中理性而系統(tǒng)地篩選與菌體形態(tài)相關的基因成為了可能。

本研究通過測定發(fā)酵上清液蛋白含量、酶活活力、發(fā)酵液粘度和菌絲干重，從95株形態(tài)突變體中篩出8株突變株，并利用顯微鏡觀察其發(fā)酵液菌絲體形態(tài)。這8株菌分別命名為SZY11、SZY32、SZY35、SZY39、SZY43、SZY63、SZY69和SZY87，其所對應的突變基因如表1所示。

表1 突變株基因功能注釋Table 1 Mutants gene annotation

突變株SZY11菌絲體呈球狀，大小約為(350±60) μm，蛋白水平較野生型菌株提高25%，發(fā)酵液粘度降低75%，但酶活、菌絲干重均未增加。從表1看出，突變株SZY11缺失基因與細胞壁蛋白合成有關，由此推測，該基因?qū)毎诮Y(jié)構(gòu)的完整性起重要作用。該基因缺失或許影響菌絲極性延伸，使菌絲變短，更易形成球狀，導致發(fā)酵液粘度降低。然而具有相似菌絲形態(tài)的突變株SZY43所缺失基因卻是鋅指轉(zhuǎn)錄因子。最近的研究表明，與纖維素降解相關的轉(zhuǎn)錄因子多來自鋅指蛋白家族，其對纖維素酶和半纖維素酶的表達調(diào)控具有重要作用。該突變株菌絲形態(tài)呈球狀，發(fā)酵液粘度降低50%，但發(fā)酵上清液蛋白含量降低22%，內(nèi)切-β-1,4-葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶活力分別下降45%和75%。由此推測，該轉(zhuǎn)錄因子的缺失不僅改變發(fā)酵液菌體形態(tài)，而且影響纖維素酶的合成與分泌[21]。此外，另一鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子突變株SZY35發(fā)酵上清液蛋白含量降低30%，內(nèi)切-β-1,4-葡聚糖酶活力下降23%。

突變株SZY87發(fā)酵液蛋白含量和酶活均有所提高，但其發(fā)酵液菌絲較長，粘度值顯著升高。SZY87菌株缺失基因可編碼一種晶狀熱激蛋白，野生型菌株在45 ℃高溫處理后可誘導該蛋白表達，使其作為分子伴侶參與呼吸代謝，提高菌株的溫度耐受性[22]。雖然并未將突變株SZY87在45 ℃下進行搖瓶培養(yǎng)，但在25 ℃下培養(yǎng)時，發(fā)現(xiàn)其發(fā)酵液中菌絲體呈長絲狀 (圖4)，說明該熱激蛋白對菌絲分化有一定影響，其生物學功能有待進一步研究探索。

無數(shù)研究表明，菌絲體形態(tài)與單個細胞的代謝存在密切聯(lián)系，但目前我們還無法清晰地闡述這種潛在的代謝和調(diào)控機制。這些與菌絲分化相關基因的獲得，為研究液體深層發(fā)酵過程中菌絲形態(tài)與代謝的關系提供了良好素材，有助于闡述關鍵基因?qū)z形態(tài)的作用，有利于深入分析菌絲形態(tài)變化對發(fā)酵性狀的影響，為理性構(gòu)建具有優(yōu)良發(fā)酵性狀的工程菌株奠定了基礎，對絲狀真菌工業(yè)發(fā)酵具有一定的實際指導意義。

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(本文責編 陳宏宇)

Improving cellulases production with Neurospora crassa by morphology mutants screening

Zhiyong Sun1,2, Liangcai Lin2, Min Wang1, and Chaoguang Tian2
1 College of Biotechnology, Tianjin University of Science and Technology, Tianjin 300457, China
2 Key Laboratory of Systems Microbial Biotechnology, Tianjin Institute of Industrial Biotechnology, Chinese Academy of Sciences, Tianjin 300308, China

Filamentous fungi are widely used for large-scale production of cellulases. Morphological characteristics of mycelia under submerged condition are closely correlated with cellulases productivity. In order to find out the critical genes involved in the mycelial morphology development and cellulases production in liquid fermentation, 95 Neurospora crassa morphological mutants (named as SZY1-95) were screened for cellulases production. Compared with the wild type, cellulases production in four mutants SZY32, SZY35, SZY39 and SZY43 were significantly decreased, whereas mutants SZY63, SZY69, SZY87 and SZY11 produced much more cellulases than that of the wild type strain. Meanwhile, endo-beta-1,4-glucanase activity, beta-glucosidase activity, viscosity of broth and dry weight of these mutants were measured. The mycelial morphology of the mutants was also studied by microscope. Particularly, pellets were formed in mutant SZY11 and SZY43, whose viscosities were 25% and 50% of the wild type strain, respectively. Mutant SZY87 appeared long hyphae, and the viscosity of its broth was at least 2 folds of the wild type strain. These results indicate that a single gene deletion could influence the mycelial morphology in liquid fermentation, and increased the cellulases production. The low-viscosity related genes identified in our study will be the potential candidates for genetic modification of filamentous fungi.

Neurospora crassa, mycelial morphology, viscosity of fermentation broth, cellulases

June 24, 2013; Accepted: October 23, 2013

Chaoguang Tian. Tel: +86-22-84861947; E-mail: tian_cg@tib.cas.cn.

Supported by: Knowledge Innovation Program of the Chinese Academy of Sciences (No. KSCX2-EW-G-8), National Basic Research Program of China (973 Program) (No. 2011CB707400), National High Technology Research and Development Program of China (863 Program) (No. SS2012AA023303).

中國科學院知識創(chuàng)新工程重要方向項目 (No. KSCX2-EW-G-8)，國家重點基礎研究發(fā)展計劃(973計劃) (No. 2011CB707400)，國家高技術研究發(fā)展計劃(863 計劃) (No. SS2012AA023303) 資助。