豬圓環(huán)病毒1型陰性PK-15細胞的單細胞克隆與鑒定

劉 宏王莉君

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學學院,新疆烏魯木齊 830000；

2.新疆天康畜牧生物技術股份有限公司,新疆烏魯木齊 830000)

豬圓環(huán)病毒1型陰性PK-15細胞的單細胞克隆與鑒定

劉 宏1王莉君2

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學學院,新疆烏魯木齊 830000；

2.新疆天康畜牧生物技術股份有限公司,新疆烏魯木齊 830000)

豬圓環(huán)病毒（porcine circovirus，PCV）屬圓環(huán)病毒科圓環(huán)病毒屬，是目前為止已知的最小的動物病毒之一。根據(jù)致病性、抗原性和核酸序列的差異，可將PCV分為PCV-1及PCV-2兩個型。PCV1為非致病性的病毒，由德國學者Tischer于1974年從多株連續(xù)傳代的PK-15細胞中最先發(fā)現(xiàn)。PCV2為致病性的病毒，來源于制備PK-15細胞的豬腎組織。豬圓環(huán)病毒對外界的抵抗力較強，對氯仿不敏感，不凝集豬、牛、羊、雞等動物和人的紅細胞。研究表明，該病毒可在RK-15細胞上生長，但不引起細胞病變，可在細胞漿內發(fā)現(xiàn)較多包涵體，少數(shù)感染的細胞還可能內含有核內包涵體。PCV不能在原代胎豬腎細胞、恒河猴腎細胞、BHK-21細胞上生長。

調查表明，PK-15細胞在被ATCC收藏后不久即檢測出PCV1，然而確切的污染來源目前尚未查清，很有可能最初的豬腎細胞PK-2a就存在PCV1，或是其他的細胞培養(yǎng)物污染導致。所以，國內細胞供給實驗室的PK-15細胞均有不同程度的PCV1污染。雖然PCV1無致病性，但由于其的存在會與PCV2發(fā)生相互污染，影響PCV2的傳代增殖，而且不利于PCV2疫苗研發(fā)及抗體檢測。綜上，有必要篩選出一株無PCV1污染的PK-15細胞。

本研究擬采用有限稀釋法篩選單細胞進行克隆，并經(jīng)PCR檢測，逐步篩選出一株豬圓環(huán)病毒1型陰性的PK-15細胞，用于PCV2的分離與傳代培養(yǎng)研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 無支原體胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基和胰蛋白酶均購自Hyclone公司公司產(chǎn)品；細胞培養(yǎng)板（nunce）、Taq DNA Polymerase、dNTP Mix、DL2000 DNA Marker、FITC-兔抗豬IgG（二抗）、氨芐青霉素、鏈霉素均購自寶信生物技術有限公司。PCV2陽性血清（一抗）購于武漢科前生物技術股份有限公司。

1.1.2 細胞株 PK-15細胞，購于武漢細胞培養(yǎng)中心。

1.1.3 引物 由于PK-15細胞起源于豬，因此細胞中存在多種豬源病毒污染。以下病毒的引物設計參見文獻[16]。引物序列具體如下：

引物名稱引物序列片段大小(bp) PCV1P1 5’-CAACTGCTGTCCCAGCTGTAG-3’1252bp P2 5’-TTCTTTATTCTGCTGGTCGG-3’1168bp P3 5’-GGTACCCGAAGGCCGATTTG-3’PCV2上游 5’-AAGGGCTGGGTTATGGTATG-3’353bp下游 5’-CGCTGGAGAAGGAAAAATGG-3’PPV上游 5’-AGGCTAACGCATGGGGAGT-3’582bp下游 5’-TGTTCCTGGGTGTTGGTCTC-3’PRV上游 5’-AGTACTCGCAGGGGCGCAACT-3’372bp下游 5’-GCCGATCTTGGTGTAGGTGT-3’CSFV上游 5’-CATTTCTTTATAGGCTCATC-3’173bp下游 5’-CTGTGGCTAATAGTGACCTAC-3’

以上引物由上海英駿生物技術有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 PK-15細胞單克隆

將PK-15細胞培養(yǎng)于細胞瓶形成細胞單層，用0.25%胰酶-EDTA消化，加入適量DMEM生長液（含2%犢牛血清和1%雙抗）吹打，分散細胞成單個，加入DMEM生長液（含10%犢牛血清和1%雙抗），做10倍梯度稀釋至大約20個細胞/ml，取100μl鋪于96孔板中，即2個細胞/孔。左右、上下?lián)u晃后放置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)12h，次日鏡下觀察孔內細胞，單個細胞的孔做好標記。培養(yǎng)7～10d后，長成單細胞克隆時，用胰酶將其消化下來，再次稀釋成單個細胞，做進一步的亞克隆，方法同上。經(jīng)兩次亞克隆后，挑選出單細胞克隆株進行擴大培養(yǎng)。細胞進行10次傳代，每傳代一次，進行一次PCV檢測。最后，對PCR檢測結果為陰性的細胞克隆株命名，并將其凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 PK-15中PCV1檢測

應用半巢式PCR的方法檢測PCV，采用25μl PCR反應體系。首先利用P1和P2引物進行第一步PCR擴增，反應條件為：94℃預變性4 min后，按94℃變性45s，64.5℃退火 60s，72℃延伸1 min，共30個循環(huán)，最后72℃延伸10 min。然后，利用P2和P3引物進行第二步PCR擴增，以第一次PCR產(chǎn)物作為模板，除退火溫度為56℃之外，其他反應條件與第一步PCR相同。PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳分析，觀察結果。

1.2.3 PK-15中外源病毒檢測

我們對克隆的PK-15細胞進行外源病毒檢測。PCR反應體系和反應條件如下：PCR反應體系（25μl/管）：10×PCR Buffer 2.5 μl、2.5mm/l dNTPs 2 μl、DNA模板、上下游引物各0.5 μl、Taq DNA polymerase 0.25 μl、ddH2O 17.25μl。各試劑加完后，吹打均勻，瞬時離心，進行如下反應條件：95℃預變性4 min；94℃變性45 s；（PPV 56.8℃、PRV 58℃、CFSV 55℃）退火45 s；72℃延伸2 min；共35個循環(huán)；最后72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物進行1%的瓊脂糖凝膠電泳，觀察PCR擴增結果。

2 結果

2.1 PK-15細胞單細胞克隆與PCV1檢測

PK-15細胞（含PCV1）經(jīng)第一次有限稀釋法克隆，得到35個克隆。細胞形態(tài)良好，輪廓清晰，比克隆前的PK-15細胞在整體上要好（圖1）。經(jīng)半套式PCR檢測，27個克隆為PCV1陽性，片段大小為1168 bp，8個克隆為PCV1陰性，沒有任何條帶（圖2-2）。說明PK-15細胞確實受到PCV1的污染。將獲得的8株細胞進行兩次亞克隆后，最終PCR檢測為PCV1陰性的單細胞克隆株命名為PK-15MC。

圖1 PK15細胞克隆前與克隆后72 h

另外將第一次PCR檢測為PCV1陰性的8個克隆株進行兩次亞克隆，并進行擴大化培養(yǎng)10代、20代、30代。每代次的細胞均進行PCR檢測，最終獲得3個PCV1陰性細胞克隆株，分別命名為PK-15MC1、PK-15MC2、PK-15MC3。

圖2 PK-15MC1克隆株的PCV1檢測

2.2 PK-15中外源病毒檢測

將最終獲得的PCV陰性克隆株PK-15MC1、PK-15MC2、PK-15MC3進行外源病毒的檢測。PCR鑒定結果如下：

圖3 PK-15MC克隆株的PRV、PPV、CSFV檢測

3 討論

因為PCV不表現(xiàn)CPE，并可長期持續(xù)污染PK15細胞而不被發(fā)現(xiàn)。另外被PCV1污染的PK15細胞，在增殖培養(yǎng)PCV2時會出現(xiàn)病毒增殖速度變慢的現(xiàn)象。這給病毒的分離純化工作帶來極大不便。有研究證實，在快速生長的細胞中會有少數(shù)細胞未被PCV1感染，因此可以通過軟瓊脂法、顯微操作法和有限稀釋法等多種方法進行單細胞的篩選，獲得無PCV存在的PK-15細胞。本研究選用相對簡單的有限稀釋法對PK-15細胞進行單克隆篩選。

半套式PCR是用第一次PCR擴增產(chǎn)物作為第二次PCR擴增的模板，并且因為第二次PCR反應中的一個引物縮進，會使靶DNA序列得到有效的選擇性擴增，大大提高了擴增的特異性和靈敏性。本試驗中在第一次克隆得到35個克隆孔中，PCR檢測有8個克隆孔為陰性，第二次亞克隆后再進行PCR檢測，僅有3個克隆孔為陰性。這種在陰性克隆中又出現(xiàn)PCV1陽性的原因，可能與病毒含量低半套式PCR檢測不出來有關。因此，本人將細胞擴大培養(yǎng)后10代、20代、30代，在進行PCV1檢測，此時病毒核酸數(shù)量遠遠超過檢測PCR下限，有利于檢測出病毒核酸來。這樣才可以獲得穩(wěn)定的不存在PCV1的PK-15細胞。本研究將獲得的3株PCV1陰性的PK-15細胞，傳代30代次后進行PCV1、PPV、PRV、CSFV等外源病毒檢測，檢測結果均為陰性。PK-15陰性細胞的獲得為臨床分離和鑒定PCV和PCV相關疫苗研制等工作提供了良好的物質保障。