豫西地區(qū)犬巴貝斯蟲病及媒介流行病學(xué)特征

尚澤松，張 才，張振芳，爨淑楠，楊自軍

（河南科技大學(xué)動物科技學(xué)院，河南 洛陽 471003）

豫西地區(qū)犬巴貝斯蟲病及媒介流行病學(xué)特征

尚澤松，張 才，張振芳，爨淑楠，楊自軍

（河南科技大學(xué)動物科技學(xué)院，河南 洛陽 471003）

為研究河南省西部地區(qū)犬巴貝斯蟲病的流行情況及媒介蜱蟲中巴貝斯蟲的攜帶率，分別運(yùn)用血液涂片及聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的方法對豫西地區(qū)2 960只犬和813只蜱蟲進(jìn)行抽樣調(diào)查。運(yùn)用體式顯微鏡對蜱進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，將部分聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)陽性產(chǎn)物進(jìn)行測序分析，鑒定蟲株。研究結(jié)果顯示：豫西地區(qū)有犬巴貝斯蟲病發(fā)生，犬患病率為3.41%；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)測序結(jié)果均為吉氏巴貝斯蟲基因序列；蜱蟲的形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果顯示：蜱蟲以鐮形扇頭蜱為主（52.4%），血紅扇頭蜱略少，蜱蟲帶蟲率為2.33%。

巴貝斯蟲??；犬；蜱；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

0 引言

巴貝斯蟲病是一種蜱傳性血液原蟲病，能引起動物及人類患病的傳染性疾病［1－2］，患病犬臨床癥狀主要表現(xiàn)為發(fā)熱、貧血和血紅蛋白尿。較為嚴(yán)重的巴貝斯蟲感染，可以通過顯微鏡檢查血涂片來確診，血涂片法也是最常用的判定巴貝斯蟲病的方法［3－4］。大多數(shù)巴貝屬寄生蟲被認(rèn)為是具有宿主專一性，但有些蟲體也能交叉感染，甚至引起人類發(fā)?。?］。有研究顯示：野生動物患巴貝斯蟲病多為隱性，貂羚、細(xì)斑馬、黑犀牛中均有巴貝斯蟲病例出現(xiàn)，且多出現(xiàn)雜交，但在家養(yǎng)動物中則較易出現(xiàn)陽性病例［4］。有資料顯示：在河南省傳播本病主要是硬蜱中的血紅扇頭蜱、鐮形扇頭蜱和長角血蜱。本病具有明顯的季節(jié)性，多發(fā)生在濕熱蜱蟲活動較頻繁的季節(jié)。中國已報道的犬巴貝斯蟲病是由吉氏巴貝斯蟲引起的，在江蘇和河南的部分地區(qū)呈地方性流行，對犬危害嚴(yán)重［5－11］。檢測犬巴貝斯蟲的常見方法有血涂片法、臨床治療法以及聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）方法等。血涂片檢測較為簡單，但是不易發(fā)現(xiàn)蟲體，易造成漏診；臨床治療法是對癥治療用殺蟲凈殺死蟲體，易于觀察到療效，但在未表現(xiàn)臨床癥狀的早中期很難發(fā)現(xiàn)感染病例，且大多數(shù)殺蟲藥有毒性，用量過多會對犬的健康造成傷害；PCR檢測則比較準(zhǔn)確、靈敏，但需要特殊設(shè)備。巴貝斯蟲病給中國畜牧業(yè)帶來危害，也給犬只健康造成極大的傷害。因此，本文主要研究犬巴貝斯蟲病的感染率、死亡率及傳播途徑，并查清寵物犬體表寄生的硬蜱感染情況，為進(jìn)一步了解豫西地區(qū)犬巴貝斯蟲病流行狀況及優(yōu)勢蟲株提供重要依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

調(diào)查對象來自各市區(qū)動物醫(yī)院就診的犬只及犬場犬只，其中，洛陽1 322份、三門峽735份、平頂山903份，調(diào)查動物醫(yī)院及犬場中犬巴貝斯蟲病的發(fā)病率。本次共調(diào)查門診病例和犬場犬只2 960只，制備相應(yīng)的血液涂片。

1.2 主要試劑

rTaq酶、dNTP、2000 DNA Marker、TakaRa全血基因提取試劑盒、TakaRa基因純化試劑盒均購自寶生物工程（大連）有限公司，吉姆薩染液購自Sigma公司。瓊脂糖購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.3 犬血涂片的染色鏡檢

將自然干燥的血涂片用甲醇固定1～2 min，用吉氏染液染色后，用蒸餾水沖洗染液并用吸耳球?qū)⒀科蹈苫蜃匀桓稍铩?/p>

1.4 犬巴貝斯蟲的PCR檢測

按寶生物工程（大連）有限公司提供的操作說明，根據(jù)10∶1的比例隨機(jī)抽檢各市區(qū)的犬血樣品293份，血液樣品分別提取犬全血基因組DNA。根據(jù)已經(jīng)建立的PCR診斷方法［12］檢測犬巴貝斯蟲病，以犬血液中提取出的基因組DNA作為PCR模板。PCR反應(yīng)體系為50 μL，包括：上、下游引物各1 μL，10× PCR緩沖液5 μL，dNTP 4 μL，DNA模板1 μL，rTaq酶0.3 μL，雙蒸水（ddH2O）37.7 μL。反應(yīng)結(jié)束后取5 μL PCR產(chǎn)物在1.0%（1 g瓊脂溶于100 mL TBE緩沖溶液）EB染色的瓊脂糖凝膠上電泳。電泳后，紫外燈下觀察結(jié)果。隨機(jī)抽取30例觀察到陽性結(jié)果的PCR產(chǎn)物，純化回收擴(kuò)增片段、送至華大基因進(jìn)行測序、鑒定該巴貝斯蟲的種類。

1.5 犬體表蜱蟲的初步調(diào)查

調(diào)查中共采集蜱蟲813只，用SZM系列體式顯微鏡進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，觀察蜱蟲的假頭、肛側(cè)板、眼、氣門、副肛側(cè)板、緣垛等部位，參照文獻(xiàn)［7－8］進(jìn)行鑒定并區(qū)分蜱蟲的種類。然后，對采集的蜱蟲隨機(jī)采樣調(diào)查，將蜱蟲進(jìn)行液氮研磨，提取組織DNA，用已建立的PCR診斷方法［12］計算蜱蟲的帶蟲率。

2 結(jié)果

2.1 犬血液涂片染色鏡檢

將犬血樣進(jìn)行吉姆薩染色后鏡檢結(jié)果（見表1）?？傆嬬R檢觀察到25例陽性病例，占總數(shù)的0.84%。

2.2 犬血液基因組DNA的PCR檢測

用已建立的PCR診斷方法［12］對293份樣品進(jìn)行檢測。PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果顯示：有陽性條帶出現(xiàn)，且與陽性品同在319 bp，陰性對照無條帶出現(xiàn)。測序結(jié)果顯示：送檢樣品基因序列均與基因庫中吉氏巴貝斯蟲序列100%相匹配。調(diào)查結(jié)果如表1所示，PCR檢測出豫西地區(qū)犬巴貝斯蟲感染率為3.41%，鏡檢感染率為0.84%，部分電泳圖片如圖1所示。

表1 豫西地區(qū)犬巴貝斯蟲病的流行情況

圖1 犬巴貝斯蟲特異性引物的PCR擴(kuò)增部分結(jié)果

2.3 巴貝斯蟲在全年調(diào)查中感染情況

2013年，在豫西地區(qū)巴貝斯蟲的感染情況如表2所示。由表2可看出：5～10月份巴貝斯蟲感染犬的病例數(shù)相對較多，6月和9月為高發(fā)期，且犬場中的感染情況低于動物醫(yī)院就診犬的感染情況。

表2 2013年在豫西地區(qū)巴貝斯蟲的感染情況例

2.4 蜱蟲形態(tài)觀察及帶蟲率

圖2～圖5為在犬只體表發(fā)現(xiàn)的蜱蟲。其中，圖2和圖3為血紅扇頭蜱。由圖2可見：該蜱為雄蜱，假頭基為六角形、有緣垛等。圖3為腹面圖像，由圖3可以明顯看出：肛側(cè)板近似三角形，副肛側(cè)板錐形，末端尖細(xì)、內(nèi)緣中部稍凹，且氣門板為逗點(diǎn)狀，判定為血紅扇頭蜱。圖4和圖5為鐮形扇頭蜱。由圖4可見：該蜱蟲為雌蜱。由圖5可以看出：內(nèi)緣中部稍凹，其下方凸角明顯，判定為鐮形扇頭蜱。調(diào)查結(jié)果顯示：813只蜱蟲中，血紅扇頭蜱為387只，占總數(shù)的47.6%；鐮型扇頭蜱為426只，占總數(shù)的52.4%。然后，對采集的蜱蟲隨機(jī)采樣調(diào)查，將蜱蟲進(jìn)行液氮研磨，用已建立的PCR診斷方法進(jìn)行診斷，診斷結(jié)果顯示：19只蜱蟲中含有犬吉氏巴貝斯蟲DNA，蜱蟲帶蟲率為2.33%。

圖2 血紅扇頭蜱背面

圖3 血紅扇頭蜱腹面

圖4 鐮形扇頭蜱背面

圖5 鐮形扇頭蜱腹面

3 討論

河南省西部地處丘陵和山區(qū)，夏秋季節(jié)溫?zé)岢睗?，蜱蟲滋生較為嚴(yán)重。作為人畜共患傳染性的巴貝斯蟲病，在河南西部地區(qū)發(fā)生較為廣泛，給豫西地區(qū)犬只飼養(yǎng)行業(yè)帶來極大的危害，也給寵物主人帶來精神上的打擊。文獻(xiàn)［11］曾捕捉到河南地區(qū)多種類別的蜱蟲，如長角血蜱、微小牛蜱、小亞璃眼蜱、血紅扇頭蜱、殘緣璃眼蜱等，研究認(rèn)為長角血蜱為優(yōu)勢種，且其密度隨季節(jié)變化［11］；據(jù)有關(guān)資料記載，傳播犬巴貝斯蟲病媒介主要是血紅扇頭蜱、鐮形扇頭蜱和長角血蜱［7］。本文調(diào)查觀察到僅有血紅扇頭蜱和鐮形扇頭蜱兩種，這與文獻(xiàn)［10］在上海市犬體表媒介蜱寄生情況初步調(diào)查中的結(jié)果相似，但這與文獻(xiàn)［11］報道的長角血蜱是河南省的優(yōu)勢品種不一致，這至少說明了長角血蜱在傳播犬巴貝斯蟲病方面不是優(yōu)勢種。研究中運(yùn)用已建立的PCR診斷方法檢測蜱蟲中的帶蟲率為2.33%，略低于巴貝斯蟲病的感染率，這可能是因為蜱蟲來源不同造成的，蜱蟲一部分來自犬只生活的草地，另一部分來自犬表皮。

犬巴貝斯蟲病的發(fā)生與傳播媒介蜱蟲直接相關(guān)。調(diào)查中發(fā)現(xiàn)犬場中巴貝斯蟲病發(fā)病率低于動物醫(yī)院就診犬只的發(fā)病率，發(fā)現(xiàn)多數(shù)患病的犬只喜歡在草地玩耍，尤其以靠近山區(qū)或丘陵者較為多發(fā)。一般而言，蜱多在春季開始出現(xiàn)，冬季消失，一年內(nèi)均有發(fā)生，但是觀察得到該病高發(fā)期大致在6月份至9月份，這應(yīng)該與豫西地區(qū)氣候環(huán)境有關(guān)，本身就溫?zé)岬牧謪^(qū)和草地。在6月份及9月份下雨較多的情況下，更利于蜱蟲的繁殖活動，所以該病的患病趨勢與蜱蟲的活躍程度呈正相關(guān)。其他月份也有病例零星出現(xiàn)，據(jù)了解這些病例均為有患病史的犬。文獻(xiàn)［1－2］認(rèn)為雖然有許多巴貝斯屬蟲體有宿主專一性，但是也有多宿主性的蟲體存在，在調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，在犬與羊共同生存的區(qū)域，犬只也有類似巴貝斯蟲病的癥狀出現(xiàn)，雖然鏡檢及PCR檢測未能檢測到蟲體，但按犬巴貝斯蟲病的治療方案可治愈，這很有可能是由于犬感染了其他種屬的巴貝斯蟲所致。文獻(xiàn)［4］在研究有袋類動物巴貝斯蟲病時提出，在雄性袋鼠中巴貝斯蟲病患病率與交配后的生理應(yīng)激有關(guān)。查訪中發(fā)現(xiàn)，雄性犬大多數(shù)是在劇烈運(yùn)動后發(fā)病，特別是配種后，這與文獻(xiàn)［4］的觀點(diǎn)基本一致。同時在調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，純種犬和引進(jìn)犬最易發(fā)生犬巴貝斯蟲病，且本地雜交犬對本病有較強(qiáng)的抵抗力，這可能是因為雜交優(yōu)勢和長期適應(yīng)的共同作用結(jié)果；還有一些犬周圍沒有蜱蟲活動也出現(xiàn)巴貝斯蟲病臨床癥狀，原因可能是：一是犬巴貝斯蟲病可通過胎盤而垂直傳播［9］，導(dǎo)致剛出生的幼犬?dāng)y帶有蟲體，另外因為人工喂養(yǎng)，使幼崽無法吸收母乳中的抗巴貝斯蟲病抗體而發(fā)??；二是通過血液水平傳播，如比特犬經(jīng)常咬斗，傷口直接接觸，或者犬只失血過多進(jìn)行血液輸血治療時均會導(dǎo)致蟲體直接進(jìn)入健康犬只血液中，進(jìn)而感染巴貝斯蟲。所以，預(yù)防犬巴貝斯蟲病可從以下幾個方面著手：首先，避免寵物犬到蜱蟲活躍的草地、樹林活動，尤其是5～10月份蜱蟲活動頻繁的季節(jié)。其次，要及時清理犬場內(nèi)雜草，必要時對環(huán)境進(jìn)行滅蟲。再次，每天盡量檢查一次犬只周身，做到盡早發(fā)現(xiàn)犬只身上的蜱蟲，盡早驅(qū)蟲。最后，運(yùn)用分子生物學(xué)方法對犬只及供血犬進(jìn)行每一階段的檢疫，達(dá)到早發(fā)現(xiàn)早治療的目的。

診斷該病常用的方法有血涂片檢測法、臨床治療法及PCR法。本次調(diào)查中3種方法均有應(yīng)用，統(tǒng)計分析中發(fā)現(xiàn)，三者有一定的交叉，但是也存在一定的差異。血涂片檢測較為簡單，但是不易發(fā)現(xiàn)蟲體，易造成漏診；臨床治療法是對癥治療用殺蟲藥殺死蟲體，易于觀察到療效，但在未表現(xiàn)臨床癥狀的早中期很難發(fā)現(xiàn)感染病例，且大多數(shù)殺蟲藥有毒性，用量過多會對犬的健康造成傷害；PCR檢測則比較準(zhǔn)確、靈敏，但需要特殊設(shè)備。為保證診斷的準(zhǔn)確性，建議使用兩種以上的診斷方法來確診該病。治療時可以依據(jù)血液中的紅細(xì)胞含量高低，進(jìn)行營養(yǎng)支持或輸血療法等治療方法來提高免疫力，但不能以血液中紅細(xì)胞損壞程度來判定巴貝斯蟲病的臨床癥狀表現(xiàn)的嚴(yán)重性［3］，應(yīng)綜合考慮犬只的肝臟和腎臟功能判定犬患病的嚴(yán)重程度。到目前為止，還未研制出能完全治愈巴貝斯蟲病的藥物，一般采用保肝藥和營養(yǎng)藥配合治療，減少犬只活動量，提高免疫力，最終達(dá)到帶蟲免疫的效果。

總之，犬巴貝斯蟲病在豫西地區(qū)廣泛流行，從而嚴(yán)重威脅豫西地區(qū)犬只的健康，所以，獸醫(yī)及飼養(yǎng)犬只的人員應(yīng)有所警惕，加強(qiáng)對犬巴貝斯蟲病及媒介蜱的防控。

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S855.9

A

1672－6871（2014）04－0073－04

國家自然科學(xué)基金項目（31001058）；國家級大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練計劃（201210464024）；河南科技大學(xué)SRTP項目（2012238，2013249）

尚澤松（1987－），女，河南周口人，碩士生；楊自軍（1963－），男，為通信作者，河南洛陽人，教授，博士，碩士生導(dǎo)師，主要從事小動物疾病及動物營養(yǎng)與中毒的研究.

2014－03－20