蓖麻毒素氣源感染小鼠后炎性因子的定量分析

鄭關(guān)雨，王全凱，王 蒙，錢 軍，劉林娜

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130118；2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院軍事獸醫(yī)研究所，吉林 長(zhǎng)春 130122；3.吉林省人獸共患病預(yù)防與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林 長(zhǎng)春 130122）

蓖麻毒素氣源感染小鼠后炎性因子的定量分析

鄭關(guān)雨1，2，王全凱1，王 蒙1，2，錢 軍2，3，劉林娜2，3

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130118；2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院軍事獸醫(yī)研究所，吉林 長(zhǎng)春 130122；3.吉林省人獸共患病預(yù)防與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林 長(zhǎng)春 130122）

蓖麻毒素會(huì)引起機(jī)體內(nèi)蛋白合成終止和細(xì)胞凋亡，通過測(cè)定組織器官內(nèi)細(xì)胞因子的表達(dá)情況可監(jiān)測(cè)機(jī)體中毒后免疫應(yīng)答反應(yīng)的發(fā)生與發(fā)展。本試驗(yàn)以氣溶膠的方式將蓖麻毒素感染給小鼠，采用熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)對(duì)攻毒后小鼠的肺臟、脾臟及胸腺中的6種炎性因子進(jìn)行定量分析。研究結(jié)果顯示：與對(duì)照組（生理鹽水組）相比，試驗(yàn)組（蓖麻毒素組）小鼠肺臟、脾臟、胸腺中的趨化因子（CCL2、CXCL2）、白介素2（IL-2）和γ干擾素（INF-γ）的信使RNA（mRNA）表達(dá)均顯著升高；而白介素1（IL-1）的信使RNA（mRNA）在肺臟、脾臟中高表達(dá)，在胸腺中為低表達(dá)；白介素4（IL-4）的信使RNA（mRNA）在肺臟、胸腺中高表達(dá)，在脾臟中為低表達(dá)。由此可知：經(jīng)毒素氣源感染后的小鼠，肺組織及免疫器官組織炎性因子分泌水平發(fā)生顯著改變，局部及整體免疫調(diào)節(jié)機(jī)能紊亂。

蓖麻毒素；炎性因子；熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)；小鼠

0 引言

蓖麻毒素是存在于蓖麻籽中的高效核糖體失活蛋白［1］。國(guó)際衛(wèi)生組織將蓖麻毒素歸類為疾病控制的B類管制品。蓖麻毒素對(duì)于哺乳動(dòng)物細(xì)胞具有強(qiáng)毒性［2］，可誘發(fā)機(jī)體細(xì)胞分泌多種炎性因子致使機(jī)體多器官損傷，這種現(xiàn)象被稱為“細(xì)胞因子風(fēng)暴”。在免疫系統(tǒng)中，細(xì)胞因子介導(dǎo)和調(diào)節(jié)天然免疫與適應(yīng)性免疫反應(yīng)，比如炎癥反應(yīng)、病原微生物感染、過敏反應(yīng)、腫瘤細(xì)胞毒效應(yīng)等［3］。當(dāng)機(jī)體發(fā)生疾病時(shí)，細(xì)胞因子表達(dá)水平必然會(huì)發(fā)生一定程度的異常，促使疾病的轉(zhuǎn)歸或加劇。所以，監(jiān)測(cè)某些細(xì)胞因子的變化對(duì)于與之相關(guān)疾病的預(yù)防、診斷、治療都具有積極的意義。細(xì)胞因子的信使RNA（mRNA）可在蛋白的轉(zhuǎn)錄階段指示細(xì)胞因子的分泌情況，常用于分析機(jī)體局部或整體的免疫程度。細(xì)胞因子的實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（QRT-PCR）是近幾年發(fā)展起來的一項(xiàng)免疫毒理學(xué)評(píng)價(jià)方法。在國(guó)外已有針對(duì)蓖麻毒素中毒后對(duì)肺部細(xì)胞因子檢測(cè)的報(bào)道［4］，但國(guó)內(nèi)相關(guān)報(bào)道尚少。

本試驗(yàn)以SYBR GreenⅠ為雙鏈DNA染料檢測(cè)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR反應(yīng)）中新核酸鏈的生成，βactin為內(nèi)參，比較定量△△CT法［5］分析數(shù)據(jù)，相對(duì)定量，比較生理鹽水氣溶膠感染組與蓖麻毒素氣溶膠感染組中肺臟、脾臟、胸腺之間兩種趨化因子、4種細(xì)胞因子表達(dá)水平差異，在核酸水平上為蓖麻毒素氣溶膠粒子對(duì)小鼠機(jī)體的免疫毒性作出評(píng)價(jià)。

1 試驗(yàn)材料與方法

1.1 材料

蓖麻毒素（本實(shí)驗(yàn)室提供）；雌性BABL／c小鼠（吉林省長(zhǎng)春市宏達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心）；Trizol（Invitrogen Life Technologies，Carlsbad，CA）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（EasyScript First-Strand cDNA Synthesis SuperAE301，Transgen）；熒光定量試劑盒（TransStart Top Green qPCRSuperMix，AQ131，Transgen）；熒光定量PCR儀（ABISTEPONEPLUS）；氣溶膠發(fā)生器（TSI3079，美國(guó)）；引物由鼎國(guó)生物技術(shù)公司合成。

1.2 小鼠攻毒及組織RNA提取

將濃度為100μg／mL的蓖麻毒素溶液通過氣溶膠的方式持續(xù)感染小鼠30 min，感染48 h后，取小鼠的肺臟、脾臟和胸腺。組織經(jīng)液氮充分研磨，取適量，采用Trizol法提取組織RNA。利用EasyScript First-Strand cDNA Synthesis Super（Transgen，AE301）反轉(zhuǎn)錄試劑盒將提取的總RNA中的mRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。

1.3 熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（QRT-PCR）

利用熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)試劑盒，采用兩步法qPCR檢測(cè)cDNA目的基因表達(dá)量。25μL反應(yīng)體系，40個(gè)循環(huán)，β-actin為內(nèi)參，比較定量法Quantitation-Comparative CT（△△CT）法，經(jīng)軟件（StepOne Software v2.1）分析，以相對(duì)量差異值（RQ）反映目的基因表達(dá)量相對(duì)變化情況。

2 結(jié)果

2.1 氣溶膠暴露后小鼠肺臟、脾臟、胸腺總RNA電泳

小鼠組織細(xì)胞為真核細(xì)胞，其總RNA被提取后經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳可出現(xiàn)3條帶，分別為真核細(xì)胞核糖體28S、18S、5S（S為沉降系數(shù)）亞基的核糖體RNA（rRNA）；本試驗(yàn)成功提取了小鼠肺臟、脾臟、胸腺組織的總RNA（見圖1）。

圖1 氣溶膠暴露后小鼠肺臟、脾臟、胸腺總RNA電泳

2.2 qPCR條件的優(yōu)化及產(chǎn)物的鑒定

經(jīng)過反復(fù)試驗(yàn)確定β-actin（持家基因，內(nèi)參）、趨化因子CCL2、CXCL2、白介素1（IL-1）、白介素2（IL-2）、白介素4（IL-4）、γ干擾素（INF-γ）最佳QRT-PCR條件，得到各基因擴(kuò)增曲線及溶解曲線，部分結(jié)果見圖2。從各個(gè)基因擴(kuò)增曲線可知：內(nèi)參基因β-actin與6種細(xì)胞因子基因有相似的擴(kuò)增效率（不同基因擴(kuò)增曲線相互之間皆呈平行趨勢(shì)），這是△△CT分析法成立的前提；所有溶解曲線皆為單峰，且在80～90℃（見圖2），擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖核酸電泳鑒定皆為100～150 bp，單一條帶（見圖3），說明擴(kuò)增條件下反應(yīng)的特異性良好。

圖2 小鼠肺臟、脾臟、胸腺中持家基因β-actin及趨化因子CCL2的擴(kuò)增曲線及溶解曲線

2.3 氣溶膠暴露后小鼠肺臟、脾臟、胸腺中6種細(xì)胞因子的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果

表1為氣溶膠暴露后小鼠肺臟、脾臟、胸腺中6種細(xì)胞因子的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果，由表1可見：試驗(yàn)組與對(duì)照組小鼠肺臟、脾臟和胸腺中6種基因表達(dá)水平差異均發(fā)生顯著變化，除脾臟中的白介素4（IL-4）和胸腺中的白介素1（IL-1）較對(duì)照組相比低表達(dá)外，其余炎性因子的表達(dá)量均高于對(duì)照組。試驗(yàn)中將各對(duì)照組RQ值（RQ值是經(jīng)過數(shù)學(xué)公式變形而來，它是判定試驗(yàn)樣品中目標(biāo)靶位點(diǎn)與在標(biāo)準(zhǔn)樣品中相同靶位點(diǎn)的表達(dá)變化情況）統(tǒng)一為1，其中，肺組織中的趨化因子CCL2、CXCL2的表達(dá)量與對(duì)照組相比分別高出195.3倍和310.2倍；脾臟中的趨化因子CXCL2和γ干擾素（INF-γ）的表達(dá)量較對(duì)照組分別高出10.0倍和36.8倍；胸腺中的兩種趨化因子CCL2與CXCL2的表達(dá)量為對(duì)照組的12.0倍和17.0倍。其他炎性因子的表達(dá)量較對(duì)照組相比要高出2～10倍。

圖3 小鼠持家基因β-actin及6種細(xì)胞因子擴(kuò)增結(jié)果鑒定

表1 氣溶膠暴露后小鼠肺臟、脾臟、胸腺中6種細(xì)胞因子的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果

3 討論

蓖麻毒素是一類核糖體失活蛋白，它能夠與28S核糖體中的RNA結(jié)合脫去核糖體上的腺甘酸，破壞核糖體引起細(xì)胞死亡［6］。蓖麻毒素具有強(qiáng)毒性，中毒后病理反應(yīng)明顯，病程較短，并迅速導(dǎo)致多器官損傷。已有報(bào)道表明小鼠中毒后多個(gè)器官發(fā)生炎癥、出血性壞死［7］。其原因一方面可能是由于蓖麻毒素直接作用于機(jī)體細(xì)胞，引起細(xì)胞蛋白質(zhì)生成障礙、過氧化損傷及凋亡［8］。同時(shí)，也有可能是蓖麻毒素激發(fā)機(jī)體神經(jīng)－內(nèi)分泌－免疫調(diào)節(jié)機(jī)制，炎性因子過度高表達(dá)或低表達(dá)，引起機(jī)體發(fā)熱、炎癥及廣泛性毛細(xì)血管滲漏綜合癥［9］。

多種多樣的細(xì)胞因子，通過調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)，在機(jī)體內(nèi)相互促進(jìn)或者相互制約，發(fā)揮著多種生物學(xué)功能［10］。機(jī)體在防御、清除“異物”時(shí)，相關(guān)細(xì)胞會(huì)分泌具有定向細(xì)胞趨化作用的小分子蛋白—趨化因子。本試驗(yàn)所選取的趨化因子（CCL2／CKCL2），白介素（IL-1、IL-2、IL-4），γ干擾素（INF-γ）皆與肺部炎癥及免疫調(diào)節(jié)有關(guān)，但其各自的分泌調(diào)控機(jī)制又有著復(fù)雜的特殊性［11］。

從本試驗(yàn)結(jié)果可看出：中毒后小鼠體內(nèi)肺部、脾臟、胸腺炎性因子表達(dá)發(fā)生顯著改變，局部及整體免疫調(diào)節(jié)機(jī)能紊亂。文獻(xiàn)［12］曾針對(duì)蓖麻毒素暴露后小鼠肺部的細(xì)胞因子表達(dá)情況進(jìn)行了研究，提示蓖麻毒素能夠引起肺部的細(xì)胞因子風(fēng)暴，本試驗(yàn)添加了兩種免疫器官，將整個(gè)機(jī)體作為研究對(duì)象。試驗(yàn)中趨化因子CCL2、CXCL2、白介素2（IL-2）、γ干擾素（INF-γ）在肺部、脾臟、胸腺均高表達(dá)，從基因表達(dá)水平說明肺部、脾臟、胸腺發(fā)生嚴(yán)重炎癥反應(yīng)，而且較偏重于Th1介導(dǎo)的細(xì)胞免疫。這可能是由于蓖麻毒素抑制細(xì)胞蛋白表達(dá)，引起細(xì)胞過氧化反應(yīng)，使免疫細(xì)胞損傷、變性及凋亡，以至于免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)紊亂。在眾多細(xì)胞因子高表達(dá)的情況下，脾臟白介素4（IL-4）低表達(dá)，胸腺的白介素1（IL-1）低表達(dá)，可能與免疫器官所主導(dǎo)的功能相關(guān)。脾臟及胸腺在小鼠中毒后萎縮明顯，細(xì)胞功能下降，免疫細(xì)胞損傷嚴(yán)重，可推測(cè)機(jī)體中毒后引發(fā)機(jī)體神經(jīng)－內(nèi)分泌－免疫調(diào)節(jié)機(jī)制，中樞免疫器官胸腺的免疫細(xì)胞生成，外周免疫器官脾臟的免疫細(xì)胞活化皆受到反饋性調(diào)節(jié)，抑制由于蓖麻毒素的呼入引發(fā)的免疫亢進(jìn)，以維持穩(wěn)態(tài)。但從整體多數(shù)細(xì)胞因子高表達(dá)來看，此時(shí)機(jī)體整體穩(wěn)態(tài)已經(jīng)處于失代償狀態(tài)。

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S852.44

A

1672－6871（2014）02－0074－04

國(guó)家“863”計(jì)劃基金項(xiàng)目（2012AA022006）；國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31101858）

鄭關(guān)雨（1988－），女，遼寧營(yíng)口人，碩士生；王全凱（1958－），男，遼寧莊河人，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)榻?jīng)濟(jì)動(dòng)物疫病防治；劉林娜為通信作者.

2013－10－11