項(xiàng)叢刺針法對(duì)缺血性腦卒中后遺癥大鼠BDNF、NGF以及神經(jīng)行為學(xué)的影響

章顯寶,汪瑛,王震,孔紅兵,汪節(jié),江六順,郭曉利,肖偉

(安徽中醫(yī)學(xué)院附屬針灸醫(yī)院,合肥 230061)

項(xiàng)叢刺針法對(duì)缺血性腦卒中后遺癥大鼠BDNF、NGF以及神經(jīng)行為學(xué)的影響

章顯寶,汪瑛,王震,孔紅兵,汪節(jié),江六順,郭曉利,肖偉

(安徽中醫(yī)學(xué)院附屬針灸醫(yī)院,合肥 230061)

目的觀察項(xiàng)叢刺針法對(duì)缺血性腦卒中后遺癥大鼠海馬區(qū)BDNF、 NGF以及神經(jīng)行為學(xué)的影響。方法80只雄性青年清潔健康級(jí)Wistar大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、治療組、西藥組,每組20只。除假手術(shù)組外,其他動(dòng)物均采用線栓法阻斷大腦中動(dòng)脈制備大鼠腦缺血模型。療程結(jié)束后,觀察大鼠神經(jīng)行為評(píng)分的變化,采用免疫組織化學(xué)染色方法檢測(cè)各組大鼠海馬區(qū)BDNF、NGF的表達(dá)。結(jié)果與假手術(shù)組比較,模型組大鼠海馬區(qū)BDNF、NGF的表達(dá)顯著升高(P＜0.01);與模型組比較,治療組與西藥組大鼠海馬區(qū)BDNF、NGF的表達(dá)均顯著升高(P＜0.01);與西藥組相比,治療組效果顯著(P＜0.05);與假手術(shù)組相比,模型組大鼠神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分顯著增高(P＜0.01);與模型組相比,治療組與西藥組大鼠神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分顯著降低(P＜0.01);與西藥組相比,治療組效果顯著(P＜0.05)。結(jié)論項(xiàng)叢刺針法對(duì)缺血性腦卒中后遺癥大鼠腦組織有神經(jīng)保護(hù)和修復(fù)作用,療效優(yōu)于西藥,其作用機(jī)制可能涉及有效上調(diào)大鼠BDNF、NGF蛋白的表達(dá)。

針刺;項(xiàng)叢刺針法;中風(fēng)后遺癥;BDNF;NGF;神經(jīng)行為學(xué);大鼠;穴位,頭頸部

缺血性腦卒中因具有高發(fā)病率、高死亡率和高致殘率的特點(diǎn)而一直倍受關(guān)注,如何積極有效地促進(jìn)缺血性腦卒中患者神經(jīng)功能恢復(fù)是目前的研究熱點(diǎn)。隨著神經(jīng)發(fā)生現(xiàn)象在成年個(gè)體神經(jīng)組織中的發(fā)現(xiàn)以及對(duì)其研究的不斷深入,為修復(fù)神經(jīng)組織治療方法的實(shí)現(xiàn)提供了可能,并因此而受到了國(guó)內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注[1-2]。有研究表明,腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(brain-derived neuro t rophic factor,BDNF)和神經(jīng)生長(zhǎng)因子(nerve growth factor,NGF)可以明顯促進(jìn)缺血后神經(jīng)元的存活和生長(zhǎng)發(fā)育并能夠防止他們受損死亡,改善神經(jīng)元的病理狀態(tài),促進(jìn)受損神經(jīng)元再生及分化成熟,在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷修復(fù)中具有重要的作用[3]。針刺對(duì)缺血性腦卒中的治療已被國(guó)內(nèi)外公認(rèn)[4-5],我們的前期工作也證實(shí),針刺治療能明顯改善缺血性腦卒中后遺癥患者的神經(jīng)系統(tǒng)癥狀,改善患者生活質(zhì)量及預(yù)后[6-7]。臨床上對(duì)于缺血性腦病患者的治療是長(zhǎng)期的,尤其針刺療法是治療缺血性腦血管疾病后遺癥的有效方法之一,但對(duì)其作用機(jī)制,如促進(jìn)大腦可塑性形成等方面缺乏深入探討。因此,我們選擇應(yīng)用項(xiàng)叢刺針法觀察針刺對(duì)缺血性腦卒中大鼠海馬區(qū)BDNF、NGF表達(dá)及其神經(jīng)行為學(xué)的影響,并探討其可能的作用機(jī)制,為臨床針刺治療缺血性腦卒中提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物及分組

雄性青年清潔健康級(jí)Wistar大鼠80只,體重(300±20)g,月齡為9個(gè)月,由安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(動(dòng)物合格證號(hào)為皖醫(yī)實(shí)動(dòng)準(zhǔn)第01號(hào))。實(shí)驗(yàn)前觀察飼養(yǎng)1星期,標(biāo)準(zhǔn)化環(huán)境飼養(yǎng)。隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組、模型組、治療組、西藥組,每組20只。

1.2 試劑

兔抗大鼠BDNF(武漢博士德生物工程有限公司產(chǎn)品);抗體兔抗大鼠NGF抗體(武漢博士德生物工程有限公司產(chǎn)品);生物素標(biāo)記二抗(武漢博士德生物工程有限公司產(chǎn)品)。

1.3 模型制備

采用改良線栓法制作大鼠右側(cè)MCAO局灶性腦缺血模型。假手術(shù)組大鼠麻醉后,僅暴露頸內(nèi)外動(dòng)脈分叉,不閉塞大腦中動(dòng)脈。術(shù)中用肛表-電熱毯反饋裝置保持肛溫在(37±0.5)℃。術(shù)后腹腔內(nèi)注射0.2萬U青霉素以預(yù)防感染,回籠后常規(guī)喂養(yǎng)。術(shù)后至處死前若有大鼠死亡,則補(bǔ)以同批次相似體質(zhì)量大鼠。模型成功的標(biāo)志是動(dòng)物麻醉清醒后出現(xiàn)左前肢無力向左側(cè)方爬行,或者朝左側(cè)轉(zhuǎn)圈爬行,且無煩躁不安。

1.4 實(shí)驗(yàn)干預(yù)方法

造模成功5星期后開始行針刺治療,根據(jù)“大鼠穴位圖譜”(江蘇省中醫(yī)藥研究所華興邦研究員等用模擬骨度法繪制而成),項(xiàng)叢刺取穴共9個(gè)穴點(diǎn)。①腦后正中線上取風(fēng)府、啞門、下腦戶(枕骨粗隆下方約風(fēng)府穴上1寸處)。②分別以兩風(fēng)池與風(fēng)府沿顱底作一連線,左右各分成3等份,每1等份為1個(gè)穴位。針刺時(shí)將大鼠輕輕放在特制的固定器內(nèi),大鼠保持清醒安靜狀態(tài)。穴位皮膚常規(guī)消毒后,選用蘇州醫(yī)療用品廠有限公司生產(chǎn)的華佗牌不銹鋼毫針,規(guī)格為直徑0.20 mm,針身長(zhǎng)25～50 mm,毫針與穴位皮膚呈垂直方向刺入2 mm,并采用平補(bǔ)平瀉的捻轉(zhuǎn)手法,捻轉(zhuǎn)角度60°左右,留針15 min,留針期間各行針1～2次,每日1次,最長(zhǎng)療程為15 d。西藥組給予尼莫地平片12 mg/kg溶入生理鹽水進(jìn)行灌胃,每日1次,最長(zhǎng)療程為15 d。模型組、假手術(shù)組大鼠在實(shí)驗(yàn)開始后常規(guī)飼養(yǎng),不作任何治療。

1.5 神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分

模型復(fù)制后4 d,進(jìn)行初次神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分,測(cè)試假手術(shù)組和已造模的大鼠;針刺組和西藥組在末次治療結(jié)束后分別進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分;模型組和假手術(shù)組的神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分與針刺組平行進(jìn)行。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)按Longa等[8]制定的5級(jí)評(píng)分法,0分為無功能障礙;1分為不能伸展前肢;2分為向一側(cè)旋轉(zhuǎn);3分為向一側(cè)傾倒;4分為無自主活動(dòng)伴意識(shí)抑制(取評(píng)分為1、2、3分者進(jìn)入實(shí)驗(yàn))。

1.6 標(biāo)本采集及處理

療程結(jié)束后,大鼠經(jīng)神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分完成后進(jìn)行腦組織的取材。以10%水合氯醛麻醉大鼠,開胸暴露心臟,將灌注針頭從心尖部插入升主動(dòng)脈,同時(shí)迅速剪開右心耳,依次迅速灌注20℃生理鹽水200 mL、4℃4%多聚甲醛200 mL,迅速取腦,置于4℃4%多聚甲醛固定液中過夜。每組大鼠取同部位進(jìn)行切片,參照《大鼠腦立體定位圖譜》[9]取海馬區(qū),常規(guī)上行脫水、二甲苯透明后石蠟包埋,連續(xù)切片,切片厚20 μm,然后在溫水中充分展開,貼片。每份組織取不相鄰切片3張備用。

1.7 免疫組織化學(xué)染色

切片經(jīng)二甲苯脫蠟,脫蠟后在清水中沖洗一段時(shí)間,加入3%H2O2泡10 min,從而除去內(nèi)源性的過氧化氫酶,然后倒掉H2O2,在清水中洗2次,再加入檸檬酸緩沖液,放入微波爐中蒸煮3 min(中火),冷卻至室溫,然后再蒸煮一次,冷卻至室溫;將檸檬酸緩沖液倒掉,水洗2次,并將載玻片置于PBS中5 min,洗2次,擦干組織周圍的PBS液,滴加正常山羊血清,使一些非特異性的位點(diǎn)封閉起來,然后放入37℃溫箱中30 min;滴加適當(dāng)稀釋的一抗(1：100),4℃冰箱過夜;將載玻片從冰箱中取出,放入PBS中洗3次,每次5 min,擦干組織周圍的PBS后加上生物素標(biāo)記二抗,然后置于37℃溫箱中30 min;將載玻片從溫箱中取出,放入PBS中洗3次,每次5 min,擦干組織周圍的PBS后加上SABC,然后置于37℃溫箱中30 min;將載玻片從溫箱中取出,放入PBS中洗3次,每次5 min,擦干組織周圍的PBS后加上顯色劑;將顯色后的載玻片用清水沖洗一段時(shí)間后,浸泡于蘇木精中染色30 s;將復(fù)染后的載玻片置于水中沖洗后,進(jìn)梯度乙醇脫水。最后浸泡在二甲苯中,搬到通風(fēng)柜中。用中性樹膠滴在組織旁邊,封好片子晾干。對(duì)照試驗(yàn)以正常血清和PBS代替一抗,同步進(jìn)行上述免疫組織化學(xué)染色,結(jié)果為陰性。

1.8 細(xì)胞計(jì)數(shù)及統(tǒng)計(jì)

將已染好的切片在顯微鏡下放大400倍,每只大鼠取3張相同海馬區(qū)域腦片,每張腦片在海馬隨機(jī)選取10個(gè)視野,計(jì)數(shù)此區(qū)域內(nèi)免疫組化染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù),求其平均值。實(shí)驗(yàn)測(cè)得各組數(shù)據(jù)采用均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,兩樣本均數(shù)比較采用t檢驗(yàn),多個(gè)樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析。統(tǒng)計(jì)結(jié)果用Spssforwindows11.0軟件分析。P＜0.05認(rèn)為有顯著性差異,P ＜0.01有非常顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠海馬區(qū)BDNF、NGF陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)的表達(dá)

BDNF、NGF陽(yáng)性細(xì)胞在光鏡下呈藍(lán)色與棕色相疊的點(diǎn)狀、三角狀、索狀或片狀表達(dá)痕跡。其免疫陽(yáng)性顆粒主要分布在胞漿和細(xì)胞膜表面、主干樹突和近細(xì)胞膜的胞漿處,染色較深,而包體中央細(xì)胞核處呈淡藍(lán)色。經(jīng)過1個(gè)療程治療后,假手術(shù)組大鼠在與模型組、針刺組、西藥組相應(yīng)區(qū)域相比僅見少量BDNF和NGF的表達(dá),而模型組、針刺組、西藥組海馬區(qū)BDNF和NGF陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比假手術(shù)顯著增多(見圖1、圖2)(P＜0.01);針刺組、西藥組海馬區(qū)BDNF和NGF陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較模型組增多(見圖1、圖2)(P＜0.01);而與西藥組比,針刺組海馬區(qū)BDNF、NGF陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)的表達(dá)較多(見圖1、圖2)(P ＜0.05)。各組數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表1。

表1 各組大鼠海馬區(qū)BDNF、NGF陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)表達(dá)的比較(±s)

表1 各組大鼠海馬區(qū)BDNF、NGF陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)表達(dá)的比較(±s)

注：與假手術(shù)組比1)P＜0.01;與模型組比2)P＜0.01;與西藥組比3)P＜0.05

組別 n BDNF NGF假手術(shù)組 20 3.60±1.31 4.45±1.39模型組 20 24.85±3.541)24.15±2.831)針刺組 20 33.35±3.101)2)3)34.25±2.381)2)3)西藥組 20 31.40±2.991)2)32.80±2.171)2)

圖1 各組大鼠海馬區(qū)BDNF陽(yáng)性細(xì)胞的表達(dá)(×400)

圖2 各組大鼠海馬區(qū)NGF陽(yáng)性細(xì)胞的表達(dá)(×400)

2.2 各組大鼠神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分結(jié)果

療程結(jié)束后,對(duì)各組大鼠進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分,結(jié)果見表2。與假手術(shù)組比較,模型組大鼠神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分顯著升高(P＜0.01);與模型組比較,針刺組與西藥組大鼠神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分顯著降低(P＜0.01);與西藥組比較,針刺組在降低大鼠神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分效果更佳(P ＜0.05)。

表2 各組大鼠神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分結(jié)果的比較 (±s,分)

表2 各組大鼠神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分結(jié)果的比較 (±s,分)

注：與假手術(shù)比較1)P＜0.01;與模型組比較2)P＜0.01;與西藥組比較3)P ＜0.05

組別 n 神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分假手術(shù)組 20 0.00±0.00模型組 20 2.56±0.851)針刺組 20 1.00±0.562)3)西藥組 20 1.65±0.722)

3 討論

3.1 項(xiàng)叢刺針法對(duì)缺血性腦卒中后遺癥大鼠海馬區(qū)BDNF、NGF表達(dá)的影響

BDNF和NGF同屬神經(jīng)生長(zhǎng)因子家族,又稱神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素(Neurot rophins,NTs),是近年來在神經(jīng)再生、損傷修復(fù)領(lǐng)域內(nèi)的研究熱點(diǎn)。BDNF和NGF由神經(jīng)元和神經(jīng)元支配的靶器官或星形膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生,具有多種生物活性。BDNF及NGF在中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中起重要作用,同時(shí)維持成熟的中樞及周圍神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元的正常功能[10]。BDNF可支持和促進(jìn)紋狀體多巴胺能神經(jīng)元、前腦膽堿能神經(jīng)元、視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞、顱腦和脊髓的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的存活和生長(zhǎng),而在胚胎發(fā)育的早期,NGF也能明顯促進(jìn)神經(jīng)前體細(xì)胞的增殖并促進(jìn)其分化。有研究表明,BDNF、NGF對(duì)缺血性腦損傷的神經(jīng)元有保護(hù)作用,能阻斷腦缺血時(shí)神經(jīng)元凋亡的發(fā)生[11-12]。腦缺血后,腦神經(jīng)細(xì)胞的損傷程度與BDNF和NGF的表達(dá)水平密切相關(guān),BDNF及其受體TrkB表達(dá)、NGF均增加,兩者水平增高能夠提高神經(jīng)元的抗損傷能力[13-14]。因此,腦缺血后增加的BDNF、NGF對(duì)缺血性腦損傷具有保護(hù)作用。

本實(shí)驗(yàn)顯示,在大鼠造模后5星期、治療15 d后,模型組、針刺組、西藥組大鼠海馬區(qū)BDNF和NGF表達(dá)與假手術(shù)組大鼠的表達(dá)均有顯著性差異。表明腦組織發(fā)生缺血后,腦組織BDNF、NGF表達(dá)均增加。有研究顯示[15],在神經(jīng)損傷3 d后BDNF mRNA開始緩慢增加,3～4星期達(dá)到最高峰。Hsu等[16]研究發(fā)現(xiàn),將大鼠右側(cè)大腦中動(dòng)脈閉塞30rain再開放,4 h后缺血側(cè)皮質(zhì)NGF表達(dá)增加,1～3 d表達(dá)明顯受抑制,但1～2星期出現(xiàn)第2次高峰。本實(shí)驗(yàn)時(shí)間點(diǎn)由于選取在大鼠造模后5星期開始治療,故尚無法觀察BDNF、NGF在腦缺血損傷后的變化規(guī)律。但針刺組、西藥組大鼠海馬區(qū)BDNF和NGF表達(dá)與模型組大鼠的表達(dá)均有顯著性差異,說明針刺和藥物均可以提高大鼠BDNF、NGF在腦內(nèi)的表達(dá)且保持在較高水平。持續(xù)較高水平的BDNF、NGF可以促進(jìn)缺血后神經(jīng)元的存活和生長(zhǎng)發(fā)育并能夠防止他們受損死亡,改善神經(jīng)元的病理狀態(tài),促進(jìn)受損神經(jīng)元再生及分化成熟,對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷修復(fù)起到重要的作用[3]。而針刺組與西藥組相比,大鼠海馬區(qū)BDNF、NGF表達(dá)更明顯,兩者比較有顯著性差異,表明針刺在提高大鼠BDNF、NGF表達(dá)方面效果更優(yōu)于西藥。

3.2 項(xiàng)叢刺針法對(duì)缺血性腦卒中后遺癥大鼠神經(jīng)行為學(xué)的影響

神經(jīng)功能缺損評(píng)分不僅可評(píng)價(jià)大腦中動(dòng)脈栓塞(MACO)模型制備是否成功,而且是觀測(cè)針刺對(duì)MACO大鼠治療作用的評(píng)判標(biāo)準(zhǔn),與BDNF、NGF組織學(xué)觀察相結(jié)合可反映針刺對(duì)受損神經(jīng)的修復(fù)及保護(hù)作用。

本實(shí)驗(yàn)在療程結(jié)束后采用目前常用的神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分法——改良Longa法,對(duì)大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能缺損的評(píng)分。結(jié)果顯示,假手術(shù)組的神經(jīng)功能缺損評(píng)分為0分,表明該組手術(shù)操作沒有造成腦動(dòng)脈閉塞,因而不會(huì)出現(xiàn)腦缺血的癥狀和體征。模型組的神經(jīng)功能缺損評(píng)分較高,表明大腦中動(dòng)脈的閉塞造成了大鼠的神經(jīng)功能缺損,結(jié)合模型組大鼠海馬區(qū)BDNF、NGF表達(dá),可以看出在腦缺血后腦內(nèi)BDNF、NGF表達(dá)的增高,未能完全改善大鼠的神經(jīng)功能。而與模型組比較,針刺組、西藥組大鼠神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分顯著降低。表明針刺及藥物的治療有助于大鼠神經(jīng)功能的康復(fù),其作用機(jī)制可能是針刺和藥物治療增強(qiáng)了內(nèi)源性BDNF和NGF的表達(dá),從而有助于減輕腦缺血后神經(jīng)元的損傷程度,保護(hù)受損神經(jīng)元。針刺組與藥物組相比,大鼠的神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分更低,表明針刺對(duì)大鼠神經(jīng)功能的修復(fù)效果優(yōu)于西藥。

綜上所述,項(xiàng)叢刺針法對(duì)缺血性腦卒中后遺癥大鼠腦組織有神經(jīng)保護(hù)和修復(fù)作用,療效優(yōu)于西藥,其作用機(jī)制可能涉及有效上調(diào)大鼠BDNF、NGF蛋白的表達(dá)。當(dāng)然,針刺對(duì)缺血性腦卒中大鼠腦損傷的康復(fù)作用可能是一種綜合調(diào)整的結(jié)果,其作用機(jī)理包括許多方面,增強(qiáng)其缺血腦組織的BDNF、NGF表達(dá)可能只是其中機(jī)制之一。我們將在以后的研究中進(jìn)一步探索針刺治療缺血性腦卒中的作用機(jī)制,為臨床治療缺血性腦卒中提供更多的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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Effect of Nape Cluster Acupuncture on BDNF, NGF and Neurobehaviors in Rats with Post-ischem ic Stroke Sequelae

ZHANG Xian-bao, WANG Ying, WANG Zhen, KONG Hong-bing, WANG Jie, JIANG Liu-shun, GUO Xiao-li, XIAO Wei. Anhui College of Traditional Chinese Medicine,Hefei 230061,China

ObjectiveTo investigate the effect of nape cluster acupuncture on hippocampal BDNF and NGF and neurobehaviors in rats with post-ischem ic stroke sequelae.MethodEighty clean and healthy young male Wistar rats were random ly allocated to sham operation, model, treatment and Western drug groups, 20 rats each. A rat model of cerebral ischem ia was made by thread occlusion of the m iddle cerebral artery in all the groups except the sham operation group. After the end of treatment, rat neurobehaviors were scored and hippocampal BDNF and NGF expressions were exam ined by immunohistochemical staining in every group of rats.ResultCompared with the sham operation group of rats, hippocampal BDNF and NGF expressions increased significantly in the model group (P＜0.01). Compared with the model group of rats, hippocampal BDNF and NGF expressions increased significantly in both the treatment and Western drug groups (P＜0.01). Compared with the Western drug group, the effect was marked in the treatment group (P＜0.05). Compared with the sham operation group of rats, the neurobehavior score increased significantly in the model group (P＜0.01). Compared with the model group of rats, the neurobehavior score decreased significantly in both the treatment and Western drug groups (P＜0.01). Compared with the Western drug group, the effect was marked in the treatment group (P＜0.05).ConclusionNape cluster acupuncture has protecting and repairing effects on brain tissue in rats with post-ischemic stroke sequelae. Its therapeutic effect is superior to that of Western drugs. The mechanism of its action may involve effective up-regulation of rat BDNF and NGF protein expressions.

Acupuncture; Nape cluster acupuncture; Poststroke syndrome; BDNF; NGF; Neuroethology; Points, head & neck

R2-03

A

10.13460/j.issn.1005-0957.2014.02.0181

1005-0957(2014)02-0181-04

2013-06-30

安徽省高等學(xué)校省級(jí)自然科學(xué)研究項(xiàng)目(KJ20011A186)

章顯寶(1984 - ),男,碩士,E-mail：r rzxb@163.com

肖偉(1961 - ),女,主任醫(yī)師,碩士生導(dǎo)師,研究方向?yàn)獒樉膶?duì)腦血管病臨床及其作用機(jī)制研究,Emai l：xiaowei1216@ gmail.com