新疆細(xì)毛羊leptin基因第二、三外顯子擴(kuò)增片段的多態(tài)性分析

李 輝，萬鵬程，代 蓉，石國慶

（1.石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，新疆 石河子 832003；2.新疆農(nóng)墾科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，新疆 石河子 832000；3.新疆兵團(tuán)綿羊繁育生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 石河子 832000）

新疆細(xì)毛羊leptin基因第二、三外顯子擴(kuò)增片段的多態(tài)性分析

李 輝1，2，3，萬鵬程2，3*，代 蓉2，3*，石國慶2，3

（1.石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，新疆 石河子 832003；2.新疆農(nóng)墾科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，新疆 石河子 832000；3.新疆兵團(tuán)綿羊繁育生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 石河子 832000）

根據(jù)1eptin基因在GenBank中的已知序列設(shè)計(jì)兩對引物,采用PCR-SSCP和DNA測序技術(shù)在新疆細(xì)毛羊群體中進(jìn)行單核苷酸多態(tài)性（SNPs)檢測分析。結(jié)果表明，新疆細(xì)毛羊1eptin基因第二、三外顯子都具有多態(tài)性。其中，第二外顯子擴(kuò)增片段上有AA和AB兩種基因型，AA基因型為優(yōu)勢基因型；而在第三外顯子有CC、CD兩種基因型，以CC基因型為優(yōu)勢基因型。并且經(jīng)過DNA測序發(fā)現(xiàn)，在1eptin第一內(nèi)含子上有兩處突變，即TTG三個(gè)連續(xù)堿基的插入和C→T的堿基替換；而在第三外顯子上發(fā)生了G→T替換突變。

新疆細(xì)毛羊；1eptin；PCR-SSCP

1994年美國學(xué)者Zhang等[1]首次從肥胖小鼠（ob/ob）的脂肪組織中分離出由肥胖基因（ob gene）編碼的蛋白，命名為瘦素（Leptin）。Leptin蛋白序列分析和結(jié)構(gòu)檢測表明它是由167個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)類激素，先由脂肪細(xì)胞合成并釋放入血，在分泌入血過程中去掉其中21個(gè)氨基酸構(gòu)成的N端的信號肽，最終形成有 146個(gè)氨基酸殘基的成熟瘦素；分子量為 16KD，具有強(qiáng)的親水性，以單體形式存在于血液中[2]。血清1eptin以內(nèi)分泌、外分泌或旁分泌的形式，透過血腦屏障后，作用于大腦脈絡(luò)叢、下丘腦、肝、胰、肺及腎等處的 1eptin受體，產(chǎn)生一系列廣泛的生物學(xué)效應(yīng)，對動(dòng)物能量代謝[3]、激素分泌[4]、生殖發(fā)育[5]和免疫[6]等都有調(diào)節(jié)功能。所以1eptin基因近些年被作為研究動(dòng)物生長發(fā)育、脂肪沉積和繁殖發(fā)育等的重要候選基因；尤其近些年來，研究人員發(fā)現(xiàn)1eptin基因與動(dòng)物的發(fā)情調(diào)節(jié)有著密切聯(lián)系[7]。

綿羊 1eptin基因定位在 4q32上，由3個(gè)外顯子和 2個(gè)內(nèi)含子組成，而基因編碼序列主要在第二外顯子和第三外顯子上。因此研究綿羊1eptin基因第二外顯子和第三外顯子的多態(tài)性為探究該基因與其相應(yīng)功能的關(guān)聯(lián)分析提供了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物樣品

78只新疆細(xì)毛羊耳組織樣（采集于新疆農(nóng)墾科學(xué)院試驗(yàn)羊場），采用常規(guī)的酚/氯仿抽提法提取基因組DNA，瓊脂糖凝膠電泳和分光光度計(jì)檢測合格后20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

蛋白酶K、無水乙醇、Tris-飽和酚、氯仿、常規(guī)PCR試劑（Takara公司），瓊脂糖、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺（sigma公司），DL 100 bp Marker（天根Code：DM109），變性加樣緩沖液（甲酰胺98%、10 mmo1/LEDTA （pH 8.0）1.5%、溴酚藍(lán)0.25%、二甲苯青0.25%）、瓊脂糖凝膠回收試劑盒（天根Code：DP209）。

1.3 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)Genbank數(shù)據(jù)庫1eptin基因序列（GenBank登錄號：HE605296.1），利用Primer Premier 5.0軟件在1eptin基因的第 2外顯子及第 3外顯子上各設(shè)計(jì)了 1對引物（表1），引物1eptin-1擴(kuò)增外顯子 2和部分內(nèi)含子；引物1eptin-2擴(kuò)增外顯子3。引物合成于invitrogen公司，具體見表1。

表1 PCR引物及擴(kuò)增退火溫度參數(shù)

圖1 1eptin基因外顯子2擴(kuò)增片段PCR產(chǎn)物結(jié)果圖

1.4 1eptin基因核苷酸多態(tài)性檢測分析

PCR反應(yīng)程序：95℃ 預(yù)變性 5 min；95℃30 s，退火溫度（見表1）30 s，72℃30 s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min；4℃保存。

PCR產(chǎn)物經(jīng)2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，特異性良好的PCR產(chǎn)物2.5 μL與 8 μL變性上樣緩沖液混合后，98℃變性10 min，立刻冰浴10 min，使之保持單鏈狀態(tài)。變性后的產(chǎn)物用非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳（1 mm厚度）檢測，膠經(jīng)固定、銀染、顯色、終止等過程，根據(jù)不同帶型判定基因型。基因型不同的PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠回收后送華大基因公司雙向測序。

1.5 數(shù)據(jù)處理

根據(jù)聚丙烯酰胺凝膠電泳圖，統(tǒng)計(jì)各位點(diǎn)的基因型個(gè)體數(shù)量，計(jì)算基因型頻率及等位基因頻率。

2 結(jié)果

2.1 PCR擴(kuò)增結(jié)果

檢測Leptin外顯子2和外顯子3的PCR擴(kuò)增片段大小分別為453bp、669bp。從圖1和圖2中可以看出，擴(kuò)增得到的片段大小與目的片段一致，沒有非特異性擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物可用于SSCP分析。

圖2 1eptin基因外顯子3擴(kuò)增片段PCR產(chǎn)物結(jié)果圖

2.2 SSCP及電泳結(jié)果分析

在包含外顯子2及部分內(nèi)含子的擴(kuò)增片斷SSCP檢測到2種基因型，分別命名為AA、AB。不同基因型的PCR產(chǎn)物回收后測序，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩處突變（圖3）。參考序列1118bp處篩查到TTG三個(gè)連續(xù)堿基的插入突變，1236bp處發(fā)生了C→T的堿基替換。

圖3 1eptin基因第二外顯子擴(kuò)增片段的SSCP結(jié)果及測序分析

外顯子3區(qū)段的PCR-SSCP結(jié)果顯示（圖4），在兩個(gè)品種的綿羊群體中發(fā)現(xiàn)了3種基因型，分別命名為CC、CD和DD。不同基因型的PCR產(chǎn)物測序結(jié)果與參考序列比對分析后發(fā)現(xiàn)，3515bp處發(fā)生了G→T替換突變，導(dǎo)致該處編碼氨基酸由纈氨酸變成亮氨酸。

圖4 leptin基因第三外顯子PCR-SSCP結(jié)果及測序分析

2.3 基因型頻率和等位基因頻率的統(tǒng)計(jì)

2.3.1 1eptin基因第二外顯子擴(kuò)增片段基因型和基因頻率統(tǒng)計(jì)

根據(jù)1eptin基因第二外顯子擴(kuò)增片段PCR-SSCP圖統(tǒng)計(jì)，結(jié)果顯示共有AA基因型個(gè)體56個(gè)，AB基因型22個(gè)，但是缺乏BB基因型個(gè)體。AA基因型頻率為0.72，AB基因型頻率為0.28。A等位基因頻率為0.86，B等位基因頻率為0.14。

2.3.2 1eptin基因第三外顯子擴(kuò)增片段基因型和基因頻率統(tǒng)計(jì)

根據(jù)1eptin基因第三外顯子擴(kuò)增片段PCR-SSCP圖統(tǒng)計(jì)，結(jié)果顯示共有CC基因型個(gè)體56個(gè)，CD基因型22個(gè)，但是缺乏DD基因型個(gè)體。CC基因型頻率為0.72，CD基因型頻率為0.28。C等位基因頻率為0.86，D等位基因頻率為0.14。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)通過對新疆細(xì)毛羊 1eptin基因第二、三外顯子的多態(tài)性分析研究顯示，兩個(gè)外顯子的擴(kuò)增片段上分別缺少BB和DD基因型，有可能是樣本量不足，未篩查出來，需要進(jìn)一步考證。而兩個(gè)位點(diǎn)的基因頻率和基因型頻率都相同，說明兩個(gè)位點(diǎn)上的突變可能是協(xié)同突變，有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究。Leptin是一種多功能的細(xì)胞因子，可作用于卵巢組織，干擾卵細(xì)胞發(fā)育和卵巢甾體激素的產(chǎn)生，影響卵巢功能調(diào)節(jié)激素的分泌。生理濃度的FSH不能促進(jìn)卵泡發(fā)育和排卵，1eptin可促進(jìn)下丘腦釋放GnRH，刺激垂體釋放FSH和LH，啟動(dòng)發(fā)情周期。李恭賀等檢測了水牛發(fā)情前后血清 1eptin水平的變化規(guī)律，發(fā)現(xiàn)在發(fā)情前2周內(nèi)，水牛血清1eptin水平逐步上升，但在發(fā)情后第0～12 d期間，1eptin水平波動(dòng)劇烈[8]。這些研究都表明1eptin對發(fā)情期有調(diào)控作用。劉繼龍對65例女性志愿者月經(jīng)期、卵泡期、排卵期及黃體期血清1eptin濃度進(jìn)行了檢測，發(fā)現(xiàn)血清1eptin水平在月經(jīng)周期中呈現(xiàn)生理性變化，在月經(jīng)期最低，卵泡期逐漸上升，排卵期達(dá)到最高，黃體期逐漸下降[9]。A1fer等研究發(fā)現(xiàn)小鼠子宮內(nèi)膜中1eptin的表達(dá)也呈周期性變化，從卵泡早期逐漸上升，分泌早期達(dá)高峰，以后逐漸下降[10]。

在小鼠妊娠過程中，1eptin濃度會(huì)顯著提高，低血清1eptin水平是預(yù)示妊娠終止的信號。林春蓮檢測了正常妊娠和自然流產(chǎn)婦女血清1eptin及β-hCG水平，妊娠后血清 1eptin水平開始上升，且顯著高于非妊娠組，正常妊娠組血清激素含量也明顯高于自然流產(chǎn)組[11]。石國慶等分析了綿羊妊娠早期血液1eptin水平，分別對中國美利奴新疆軍墾型細(xì)毛羊(單胎)和江蘇湖羊(多胎)各組的血清進(jìn)行放免測試。結(jié)果顯示，妊娠母羊1eptin水平高于空懷母羊，雙胎母羊體內(nèi)的 1eptin水平高于單胎母羊[12]，說明 1eptin與綿羊妊娠和繁殖率有一定的關(guān)系，1eptin可作為早期妊娠的檢測指標(biāo)之一。

在本研究中利用PCR-SSCP和DNA測序相結(jié)合的方法，分析了1eptin基因兩個(gè)外顯子的多態(tài)性。在新疆細(xì)毛羊群體里共檢測到3個(gè)多態(tài)位點(diǎn)，其中第三外顯子 G→T替換突變，導(dǎo)致該處編碼氨基酸由纈氨酸變成亮氨酸。這些多態(tài)位點(diǎn)與新疆細(xì)毛羊季節(jié)性發(fā)情之間的關(guān)系及調(diào)控機(jī)制還有待深入研究。

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Study on the Polymorphism of Leptin Exon2 and Exon3 in Xinjiang fine-Wool Sheep

LI Hui1,2，WAN Peng-cheng2,3*，DAI Rong2,3*，SHI Guo-qing2,3
（1．Co11ege of Anima1 Science and Techno1ogy，Shihezi University,Shihezi 832003，China；2．Institute of Anima1 Husbandry and Veterinary,Xinjiang Academy of Agricu1tura1 and Rec1amation Sciences，Shihezi 832000,China；3．Key Lab of Sheep Breeding and Reproduction，Xinjiang Agrorec1amation Academy of Sciences，Shihezi 832000,China）

According to the known sequence of 1eptin gene from GenBank,two primers were designed.The study used gene sequencing and PCR-SSCP assay to ana1yze the sing1e nuc1eotide po1ymorphisms(SNPs)of the Xinjiang fine-woo1 sheep.The resu1ts showed that both exon 2 and exon 3 of 1eptin in Xinjiang fine-woo1 sheep were of the po1ymorphism.Two genotypes AA and AB were detected on the amp1ified fragment of the exon 2,of which the genotype AA was dominant.And two genotypes CC and CD were detected on the amp1ified fragment of the exon 3,the genotype CC was dominant in it.Using gene sequencing assay,we found that three consecutive bases TTG inserted and C/T mutated in intron 1 and G/T mutated in exon 3 of 1eptin.

Xinjiang fine-woo1 sheep；1eptin；PCR-SSCP

S814.8

：A

：1003－6377（2014）02－0019-05

2013-12-27

國家科技支撐計(jì)劃（2011BAD28B05-1-1）；863計(jì)劃（2011AA100307）；兵團(tuán)博士基金（2014BB015）；新疆兵團(tuán)綿羊繁育生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放課題（2013KLS07）

李輝（1988-），男，碩士研究生，研究方向：動(dòng)物遺傳育種與繁殖。

萬鵬程（1977-），男，副研究員，研究方向：綿羊繁育與家畜胚胎生物技術(shù)研究。

代蓉（1977-），女，副研究員，研究方向：動(dòng)物遺傳育種。