硅藻土提取LC-MS/MS法測(cè)定血液中馬錢(qián)子堿和士的寧

吳玉紅，邵 博，宋 鵬

（1.重慶警察學(xué)院，重慶 401331；2.黑龍江省公安廳，黑龍江 哈爾濱 150008；3.上海市公安局，上海 200025）

硅藻土提取LC-MS/MS法測(cè)定血液中馬錢(qián)子堿和士的寧

吳玉紅1，邵 博2，宋 鵬3

（1.重慶警察學(xué)院，重慶 401331；2.黑龍江省公安廳，黑龍江 哈爾濱 150008；3.上海市公安局，上海 200025）

用硅藻土提取血液中馬錢(qián)子堿和士的寧，用LC-MS/MS測(cè)定的方法。取檢血1.0毫升加水溶液1.0毫升倒入硅藻土層析柱中，加二氯甲烷洗脫，洗脫溶劑中添加內(nèi)標(biāo)SKF525A，濃縮至干。剩余物用1.0毫升甲醇溶解，進(jìn)行LC-MS/MS分析。士的寧和馬錢(qián)子堿檢出限分別為1.9納克/毫升和2.3納克/毫升；提取率均達(dá)到95%以上；線性范圍0.01微克/毫升～10微克/毫升。該法可作為法醫(yī)毒物常規(guī)檢驗(yàn)方法。

馬錢(qián)子堿；士的寧；血液；硅藻土；LC-MS/MS

馬錢(qián)子堿和士的寧共存于馬錢(qián)屬的許多植物中，是一種常見(jiàn)的生物堿。士的寧是一種中樞神經(jīng)興奮劑，醫(yī)療上常用于治療弱視癥、癱瘓及再生障礙性貧血。馬錢(qián)子堿常用于治療中風(fēng)引起的神經(jīng)麻痹和用作健胃藥，使用不當(dāng)或服藥過(guò)量，會(huì)引起中毒甚至死亡。

目前，生物檢材中馬錢(qián)子堿和士的寧的檢驗(yàn)方法有紫外導(dǎo)數(shù)光譜法、［1］氣相色譜法、氣相色譜——質(zhì)譜聯(lián)用法［2］和高效液相色譜法，［3］以氣相色譜——?dú)赓|(zhì)聯(lián)用法最為常見(jiàn)。由于兩種生物堿分子量相對(duì)較大，不易汽化，應(yīng)用氣相色譜和氣相色譜——?dú)赓|(zhì)聯(lián)用法需采用較高的柱溫，靈敏度低，易造成柱流失，而采用高效液相色譜法易拖尾。為此，筆者建立了硅藻土提取方法和高效液相色譜——二級(jí)質(zhì)譜聯(lián)用檢測(cè)技術(shù)，方法簡(jiǎn)單快速，提取率高，靈敏度高。

一、實(shí)驗(yàn)部分

（一）儀器、材料及試劑

LXQ液相色譜——質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國(guó)Thermo Fisher公司）。

硅藻土：上海化學(xué)試劑廠進(jìn)口分裝，粒度為0.02毫米~0.045毫米。

人血：購(gòu)自黑龍江省中心血站，加抗凝劑袋裝保鮮人血，冷凍備用。

馬錢(qián)子堿、士的寧：分析純，質(zhì)量符合國(guó)家藥典規(guī)定；用甲醇配制成1.0毫克/毫升標(biāo)準(zhǔn)溶液。

甲醇為色譜純；乙醚、二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯、乙酸銨溶液、醋酸、醋酸鈉、碳酸、碳酸氫鈉等均為分析純。

（二）檢測(cè)方法

1.儀器條件

液相條件：色譜柱HyPuRiTY C18 ODS（2.1毫米×150毫米 Column）（Thermo公司生產(chǎn)），流速0.20毫升/分鐘，采集時(shí)間15分鐘，進(jìn)樣量10.0微升，流動(dòng)相：甲醇——5毫摩爾/升，乙酸銨溶液（pH=3.0～4.0）=70∶30。

質(zhì)譜條件：采用電噴霧電離（IonSprary）-陽(yáng)離子模式（ESI+）進(jìn)行MRM方式檢測(cè)，碰撞能量（CE）為35.0伏特，噴射電壓5千伏，毛細(xì)管溫度350攝氏度。

2.檢測(cè)方法

取檢血1.0毫升加水溶液1.0毫升倒入硅藻土層析柱中，加二氯甲烷洗脫，收集8.0毫升洗脫溶劑，添加5.0微升1.0毫克/毫升內(nèi)標(biāo)SKF525A，于50攝氏度水浴濃縮至干。剩余物用1.0毫升甲醇溶解。0.45微米濾膜過(guò)濾后，取10.0微升進(jìn)行LC-MS/MS分析，內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線法進(jìn)行定量分析。

二、結(jié)果與討論

（一）工作曲線的制備

取1.0毫升空白血檢材15份，分別加入0.01、0.1、1.0、5.0、10.0微克的士的寧、馬錢(qián)子堿標(biāo)準(zhǔn)樣品。按照上述方法進(jìn)行提取，在洗脫液中分別添加SKF525標(biāo)準(zhǔn)品5.0微克，濃縮后取10.0微升進(jìn)樣。繪制工作曲線，線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)為：士的寧y=0.09x+0.01，r＝0.9897；馬錢(qián)子堿y= 0.31x+0.04，r＝0.9890。

（二）硅藻土萃取條件的確定

取空白血液1.0毫升，添加100.0微克/毫升混合標(biāo)準(zhǔn)工作液1.0微升。分別在pH5.0、pH7.0、pH9.0條件，用乙醚、二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯下進(jìn)行分別提取，提取率見(jiàn)表1。

表1 血液中士的寧、馬錢(qián)子堿在不同pH及洗脫溶劑條件下提取率考察（n=5）

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，血中士的寧、馬錢(qián)子堿的提取率受PH影響不大，用二氯甲烷作為洗脫溶劑，均能得到較好的提取效果。

（三）儀器條件的確定

1.質(zhì)譜條件的優(yōu)化

采用注射泵直接進(jìn)樣的方式，以20.0微升/分鐘將10.0納克/毫升的士的寧、馬錢(qián)子堿標(biāo)準(zhǔn)溶液和SKF525A對(duì)照品溶液分別注入離子源中，采用儀器自動(dòng)調(diào)諧的方式，獲得最優(yōu)的質(zhì)譜檢測(cè)條件，見(jiàn)表2。在正離子檢測(cè)方式下對(duì)它們進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜分析，得到2種化合物的分子離子峰，然后分別對(duì)準(zhǔn)分子離子峰進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜分析。選擇士的寧、馬錢(qián)子堿和SKF525A的檢測(cè)離子對(duì)，見(jiàn)表3。

2.液相色譜條件的優(yōu)化

由于士的寧、馬錢(qián)子堿和SKF525A易溶于甲醇，選擇甲醇作為流動(dòng)相之一，同時(shí)選擇水和5毫摩爾/升乙酸銨作為流動(dòng)相之二。色譜結(jié)果表明，加入乙酸銨后峰形明顯改善，提示應(yīng)選擇甲醇-5毫摩爾/升乙酸銨作為流動(dòng)相溶劑。選擇不同比例（90∶10，80∶20，70∶30，60∶40，50∶50，40∶60）的甲醇-5毫摩爾/升乙酸銨溶液作為流動(dòng)相，分別觀察它們的出峰情況。結(jié)果顯示，甲醇含量減少，出峰時(shí)間過(guò)長(zhǎng)；甲醇含量過(guò)大，峰拖尾嚴(yán)重；選擇甲醇-5毫摩爾/升乙酸銨比例為70∶30時(shí)峰形和保留時(shí)間均較為合適。

表2 士的寧、馬錢(qián)子堿的質(zhì)譜調(diào)諧參數(shù)

表3 士的寧、馬錢(qián)子堿檢測(cè)離子對(duì)

（四）檢出限

取空白血液1.0毫升5份，按文中方法進(jìn)行提取，添加內(nèi)標(biāo)20納克/毫升進(jìn)行測(cè)定，得到空白血色譜圖。另取血添加藥物20納克/毫升、內(nèi)標(biāo)20納克/毫升，同上進(jìn)行提取測(cè)定，以“基線噪音”3倍的檢材藥物含量得檢出限。結(jié)果檢出限士的寧為1.9納克/毫升，馬錢(qián)子為2.3納克/毫升。

（五）提取率

取1.0毫升血液，分別添加士的寧、馬錢(qián)子堿0.1微克，1.0微克，10.0微克，按照本文“血液中士的寧、馬錢(qián)子堿提取方法”進(jìn)行提取，使用LC-MS/MS檢測(cè)，所得2種藥物提取率見(jiàn)表4。

表4 血中士的寧、馬錢(qián)子堿的提取率（n=5）

（六）中毒實(shí)驗(yàn)

取體重2.5千克家兔1只，灌服馬錢(qián)子堿30毫克，15分鐘處死，解剖取心血，按本文方法測(cè)定，測(cè)值為8.7微克/毫升。

［1］吳玉紅，許英鍵.血、尿中馬錢(qián)子堿硅藻土提取紫外三階導(dǎo)數(shù)光譜測(cè)定法研究［J］.廣東公安科技，2004，（4）.

［2］呂霞，郭青，鐘文英.GC—MS法測(cè)定疏風(fēng)活絡(luò)丸中偽麻黃堿、麻黃堿、士的寧和馬錢(qián)子堿的含量［J］.中國(guó)藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，（6）.

［3］王朝虹，果德安，胡春華.反相高效液相色譜法測(cè)定全血中馬錢(qián)子堿和士的寧的含量［J］.色譜，2003，（4）.

（責(zé)任編輯：陳尚坤）

D918.93

A

1671-0541（2014）06-0049-03

2014-06-05

吳玉紅（1964-），女，遼寧大連人，重慶警察學(xué)院教授，主要研究方向：毒物分析；邵博（1982-），女，黑龍江哈爾濱人，黑龍江省公安廳從事表物分析工作；宋鵬（1983-），男，山東煙臺(tái)人，上海市公安局從事表物分析工作。

本文系重慶市公安局科研課題《植物毒素的提取與檢測(cè)技術(shù)研究》階段性研究成果，項(xiàng)目編號(hào)：G2013-26。