人體淋巴母細(xì)胞建株方法的改進(jìn)研究

熊樂琴 馬昌杯 李善妮 帥云飛

隨著人類社會(huì)的發(fā)展, 遺傳多樣性的保存顯得尤為重要,對(duì)于全球性生物多樣性研究具有重大意義。人類突變細(xì)胞是研究人類生物學(xué)特征的重要資源, 也是在細(xì)胞水平上開展遺傳病研究的寶貴材料。在傳統(tǒng)的淋巴母細(xì)胞建株方法的基礎(chǔ)上, 作者于2012年1月～2013年12月對(duì)此進(jìn)行了改進(jìn), 效果明顯, 建株時(shí)間在18 d左右, 且成功率保持在95%以上,有效提高了淋巴母細(xì)胞建株的成功率, 縮短了建株時(shí)間, 操作簡(jiǎn)便, 為人類突變細(xì)胞的收集、保存以及遺傳資源的保存創(chuàng)造了有利條件, 值得推廣應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 材料 1640培養(yǎng)基(pH7.2±0.1)、谷氨酰胺(glutamine)、血清、環(huán)孢霉素(Ciclosporin)、淋巴細(xì)胞分離液(lymphocyte isolation)、EB病毒。

1.2 EB病毒的制備 方法一：選取B95-8細(xì)胞, 用前1天內(nèi)進(jìn)行換液, 并反復(fù)凍融2～3次, 將收集的上清液進(jìn)行過濾,4～5℃保存。方法二：運(yùn)用傳統(tǒng)方法對(duì)EB病毒進(jìn)行制備,-70℃保存。

1.3 人類淋巴母細(xì)胞建株 取外周血4～5 ml, 與2～3 ml 1640培養(yǎng)基(pH 7.2±0.1)在離心管中進(jìn)行混合, 并將混合液注入置含有2～3 ml淋巴細(xì)胞分離液的離心管中, 待靜置1 min后,離心后分離淋巴細(xì)胞, 洗滌3次, 注入培養(yǎng)液(1 mmol/L谷氨酰胺, 25%血清) 6 ml, 隨機(jī)平均分為6份, 共3組。①、②組加入0.5 ml血清以及方法一制備的EB病毒1 ml, ③組加入傳統(tǒng)方法制備的EB病毒1 ml；每份加入適量環(huán)孢霉素, 輕輕混勻。①組、②組采取36℃開放式培養(yǎng), 2 d后半量換液,并加入適量環(huán)孢霉素和EB病毒, 保持環(huán)孢霉素的濃度, 此后每隔3 d進(jìn)行換液；7 d后對(duì)①組標(biāo)本行活細(xì)胞分離, 待細(xì)胞數(shù)達(dá)到目標(biāo)范圍后進(jìn)行細(xì)胞核型分析以及凍存。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析, 成功率比較采用χ2檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 69例淋巴母細(xì)胞標(biāo)本建株情況 對(duì)比分析三組淋巴母細(xì)胞建株的成功率, 其中①組的建株成功率最高, 為91.3%；③組成功率最低, 為39.1%, 詳見表1。

表1 各組淋巴母細(xì)胞建株成功率比較(n, %)

2.2 淋巴母細(xì)胞的生長(zhǎng)狀況 ①組、②組3 d后可發(fā)現(xiàn)大量細(xì)胞生長(zhǎng)迅速, 少量細(xì)胞死亡；5 d后可發(fā)現(xiàn)大量細(xì)胞呈團(tuán)塊狀, 團(tuán)塊表面存在黑色顆粒, 折光度減小, 中間存在少量活細(xì)胞；7 d后現(xiàn)象更為明顯。①組經(jīng)活細(xì)胞分離后, 細(xì)胞的生長(zhǎng)速度加快, 而②組則生長(zhǎng)緩慢；③組在4～6 d后可發(fā)現(xiàn)部分細(xì)胞粘于瓶壁, 有少量懸浮的細(xì)胞團(tuán)塊, 折光度低,存在大量的死細(xì)胞, 細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢。

3 討論

EB病毒可以選擇性地將B淋巴細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化, 環(huán)孢霉素可以在細(xì)胞的G0、G1期選擇性抑制T淋巴細(xì)胞中的RNA聚合酶Ⅱ的活性, 從而有效阻斷T細(xì)胞的繁殖, 避免已經(jīng)轉(zhuǎn)化的B淋巴細(xì)胞由于T淋巴細(xì)胞的介入而導(dǎo)致退化［1］。采用方法一制備EB病毒是當(dāng)B95-8細(xì)胞達(dá)到平臺(tái)期后采集EB病毒, 由于此時(shí)的B95-8細(xì)胞能釋放出大量的EB病毒,因此感染力強(qiáng), 效果明顯；采用方法二制備EB病毒, 并將其置于-70℃儲(chǔ)存, 大量的EB病毒會(huì)失去自身的感染力, 在開始階段, 難以轉(zhuǎn)化成B淋巴細(xì)胞, 效果較差［2］。2 d后, 由于經(jīng)EB病毒感染后的T淋巴細(xì)胞大部分仍然具有應(yīng)答反應(yīng),另有一些T淋巴細(xì)胞未受到環(huán)孢霉素的干擾, 因此, 需往培養(yǎng)液中添加適量的環(huán)孢霉素以及EB病毒。培養(yǎng)5d后, 由于大部分B淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化充分, 且T淋巴細(xì)胞由于受到環(huán)孢霉素的干擾逐漸退化, 甚至死亡, 并釋放出多種酶以及大量的細(xì)胞碎片, 這些酶以及細(xì)胞碎片一定程度上會(huì)影響B(tài)淋巴細(xì)胞的增殖, 甚至導(dǎo)致已經(jīng)轉(zhuǎn)化的B淋巴細(xì)胞退化、凋亡。將建株成功的標(biāo)本靜置培養(yǎng)1周, 可在試管底部的沉降細(xì)胞周圍發(fā)現(xiàn)生長(zhǎng)暈, 進(jìn)行半量換液后, 9～11 d轉(zhuǎn)瓶, 顯微鏡可觀察到胞質(zhì)突出、聚集成團(tuán)、形態(tài)各異的細(xì)胞株, 此后4～6 d傳代一次, 經(jīng)過5～6次傳代后可使細(xì)胞懸液達(dá)到60 ml左右,即可凍存。此次研究表明, ①組加入的淋巴細(xì)胞分離液可以促進(jìn)淋巴細(xì)胞的進(jìn)一步分離, 去除有害物質(zhì)以及壞死細(xì)胞,從而加快了B淋巴細(xì)胞的生長(zhǎng)速度, 提高了淋巴母細(xì)胞的建筑成功率, 縮短了建株時(shí)間, 其效果要明顯好于②組、③組。

［1］ 陳寶安, 馬金龍, 劉苒, 等.bcr-abl融合基因陽性慢性髓系白血病繼發(fā)髓外T淋巴母細(xì)胞病變一例報(bào)告附文獻(xiàn)復(fù)習(xí).中華血液學(xué)雜志, 2011, 32(10): 693-694.

［2］ 莫小輝, 宋寧?kù)o, 陳佳, 等.EBV轉(zhuǎn)化帶狀皰疹患者外周血B淋巴母細(xì)胞系的建立.免疫學(xué)雜志, 2013, 29(7): 615-618.