胎膜早破與細(xì)胞凋亡調(diào)控基因Bcl—2、Bax和細(xì)胞色素—C的相關(guān)性研究

馬秀英　孫衛(wèi)娜

【摘 要】目的：研究細(xì)胞凋亡增加是否為胎膜早破的一個(gè)發(fā)病機(jī)理和危險(xiǎn)因素。方法：隨機(jī)選擇經(jīng)陰道分娩的足月初產(chǎn)婦60例的胎膜，其中胎膜早破30例作為研究組，余30例 為對(duì)照組。結(jié)果：采用免疫組化法檢測(cè)兩組胎膜組織中細(xì)胞凋亡調(diào)控因子（Bax、Bcl-2）及細(xì)胞色素C（Cyt-C）的表達(dá)情況的陽(yáng)性表達(dá)率高于對(duì)照組（p<0.005），但抑凋亡蛋白的Bcl-2陽(yáng)性表達(dá)率兩組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（p>0.005）。結(jié)論：胎膜早破的發(fā)生與促凋亡蛋白Bax、Cyt-c表達(dá)的增強(qiáng)相關(guān)，基因調(diào)控下胎膜細(xì)胞凋亡增加可能是胎膜早破的一個(gè)重要發(fā)病機(jī)制。

【關(guān)鍵詞】胎膜早破；細(xì)胞凋亡；Bcl-2；Bax；細(xì)胞色素C

【中圖分類號(hào)】R714 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A 【文章編號(hào)】1004-7484（2014）05-2742-01

胎膜早破（Premature rupture of membranes，PROM）是指臨產(chǎn)前的胎膜破裂，是嚴(yán)重威脅母兒健康的產(chǎn)科常見(jiàn)并發(fā)癥。近年來(lái)有關(guān)胎膜早破的病因?qū)W方面的研究日趨增多。目前主要是從分子和基因水平上探討胎膜本身結(jié)構(gòu)的變化，研究表明胎膜中存在凋亡并受一些凋亡調(diào)節(jié)基因的調(diào)控[1]，但胎盤上的凋亡調(diào)控機(jī)理尚無(wú)定論。本研究皆在通過(guò)免疫組化技術(shù)了解細(xì)胞凋亡調(diào)控基因Bcl-2、Bax、細(xì)胞色素-C（Cytochrome-c，Cyt-c），在胎膜中的表達(dá)及相互關(guān)系，探討其在PROM中的作用，明確其是否為PROM的一個(gè)發(fā)病機(jī)制或危險(xiǎn)因素，為胎膜早破的預(yù)防和治療提供科學(xué)的依據(jù)和新思路。

1 資料與方法

1.1研究對(duì)象

隨機(jī)選擇2009年12月至2011年1月在我院婦科科住院的經(jīng)陰道分娩的足月初產(chǎn)婦60例，其中30例PBOM孕婦作為研究對(duì)象（PROM組），排除機(jī)械性損傷和多胎、胎位異常、頭盆不稱等原因所至的PROM，臨床無(wú)感染征象，無(wú)其他產(chǎn)科合并癥和并發(fā)癥，近期無(wú)外傷和性交等明顯誘因，且PROM組均在破膜12h以內(nèi)分娩；未發(fā)生PROM的孕婦作為正常妊娠組（對(duì)照組），符合上述條件，并與研究組年齡、孕周相對(duì)應(yīng)。

兩組孕婦年齡、孕周、孕次及新生兒體重的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，資料具有可比性。PROM診斷標(biāo)準(zhǔn)按樂(lè)杰主編的第6版《婦產(chǎn)科學(xué)》[2]中的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)。

1.2方法

1.2.1標(biāo)本采集：兩組孕婦均在胎盤娩出后10min內(nèi)于胎膜破裂口處3cm內(nèi)采取2cmX2cm的新鮮羊膜組織。標(biāo)本采取后立即用生理鹽水洗凈血跡，無(wú)菌棉簽試蛻膜組織后，置入4%甲醛溶液中固定，常規(guī)石蠟包理標(biāo)本，連續(xù)4μm厚切片4張，其中3張備免疫組化染色用，另1張備隨機(jī)抽取予PBS染色行陰性對(duì)照。

1.2.2實(shí)驗(yàn)方法：用免疫組化SP法分別檢測(cè)標(biāo)本中的Bas、Bcl-2、Cyt-c的性表達(dá)。北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司提供鼠抗人Bax單克隆抗體、鼠抗人Bcl-2單克隆抗體及鼠抗人Cyt-c單克隆抗體，SP系列工作盒和顯色劑試劑盒。染色按試劑盒說(shuō)明操作、抗稀釋度1：50，磷酸鹽緩沖液代替-抗作陰性對(duì)照，分別用已知Bax、Bcl-2、Cyt-c陽(yáng)性組織切片作陽(yáng)性對(duì)照。

1.2.3結(jié)果判定[3] ：光學(xué)顯微鏡下觀察，以細(xì)胞漿內(nèi)出現(xiàn)淺黃色、黃色或棕黃色沉著，染色明顯高于背景為陽(yáng)性細(xì)胞。每例標(biāo)本隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野（X400），計(jì)算每個(gè)視野陽(yáng)性細(xì)胞比例得分和染色強(qiáng)度得分，以5個(gè)視野的平均值確定陽(yáng)性細(xì)胞比例得分和染色強(qiáng)度得分，以5個(gè)視野的平均值確定陽(yáng)性表達(dá)度。陽(yáng)性表達(dá)度=陽(yáng)性細(xì)胞得分+染色強(qiáng)度得分：①陽(yáng)性細(xì)胞評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)：無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞=0分；陽(yáng)性細(xì)胞<25%=1分，25%～50%=2分，>50%=3分；②染色強(qiáng)度評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)：不著色=0分，淺黃色=1分，黃色=2分，棕黃色=3分，均值0分為陰性（一），1～2分為弱陽(yáng)性=（+），3～4分為中度陽(yáng)性（++），5～6分為強(qiáng)陽(yáng)性（+++）。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS11.5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，各數(shù)據(jù)用x±s表示。采用t檢驗(yàn)，x2檢驗(yàn)，p<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

Bcl-2、Bax、Cyt-c陽(yáng)性反應(yīng)物：Cyt-c和促凋亡基因Bax、抑凋亡基因Bcl-2在絨毛膜滋養(yǎng)細(xì)胞和羊膜上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞及間質(zhì)胞漿內(nèi)均有表達(dá)。兩組中Bcl-2陽(yáng)性表達(dá)率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；PROM組Bax和Cyt-c的陽(yáng)性表達(dá)率均高于對(duì)照組，差異有顯著性意義，見(jiàn)表1-3。

3 討論

3.1胎膜早破與細(xì)胞凋亡

胎膜由胎膜細(xì)胞及其所產(chǎn)生的細(xì)胞外基質(zhì)組成，在整個(gè)妊娠過(guò)程中胎膜的組織結(jié)構(gòu)對(duì)維護(hù)胎膜的完整性，保證妊娠的順利發(fā)展，防止胎膜早期破裂的發(fā)生起著重要的作用。從整個(gè)妊娠過(guò)程觀察，覆蓋于子宮頸內(nèi)口的胎膜組織及其變化是趨向于變薄和弱化，其目的是利于產(chǎn)程的開(kāi)始[4]。若這個(gè)過(guò)程加速或程度加重，勢(shì)必導(dǎo)致胎膜組織結(jié)構(gòu)的改變，當(dāng)胎膜組織的結(jié)構(gòu)發(fā)生異常，以至少胎膜組織不能隨妊娠以后逐漸增加的宮腔內(nèi)的壓力即可發(fā)生胎膜破裂。因此，胎膜細(xì)胞功能及形態(tài)、結(jié)構(gòu)發(fā)生改變將直接導(dǎo)致胎膜性狀的改變，乃至造成胎膜的破裂。

細(xì)胞凋亡（apoptosis，APO）即細(xì)胞的程序化死亡，是因?yàn)榧?xì)胞內(nèi)外環(huán)境變化或死亡信號(hào)觸發(fā)以及在基因調(diào)控下所引起細(xì)胞的主動(dòng)死亡過(guò)程，是機(jī)體組織清除受損、衰老或多余細(xì)胞的一種自殺方式，它對(duì)于胚胎的發(fā)生，機(jī)體正常的生長(zhǎng)發(fā)育以及免疫監(jiān)督，免疫防御系統(tǒng)功能和維持等方面都具有重要意義[5]。多項(xiàng)研究資料表明[6-8]，PROM者的胎膜組織明顯變薄，而絨毛膜的膠原纖維、基底膜、纖維母細(xì)胞和滋養(yǎng)葉細(xì)胞呈現(xiàn)發(fā)育不良和老化現(xiàn)象，而羊膜結(jié)締組織中的肌成纖維細(xì)胞的數(shù)密度和體密度明顯變低；在胎盤及胎膜組織中可以可見(jiàn)凋亡細(xì)胞的存在；在正常足月分娩和PROM產(chǎn)程發(fā)動(dòng)中，包括膠原、氨基葡聚糖和層粘連蛋白等在內(nèi)的細(xì)胞外基質(zhì)成分無(wú)明顯改變。

因此，細(xì)胞凋亡可能在胎膜細(xì)胞生長(zhǎng)、發(fā)育、分化和再生過(guò)程乃至胎膜結(jié)構(gòu)重建中起著重要的調(diào)節(jié)作用，這可能與胎膜細(xì)胞發(fā)生凋亡后產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)減少有關(guān)，這些基質(zhì)對(duì)胎膜起著骨架支撐作用，是維持胎膜結(jié)構(gòu)的重要部分，其產(chǎn)生減少后，胎膜強(qiáng)度和韌度減弱，最終導(dǎo)致PROM的發(fā)生。

3.2 Bcl-2、Bax與胎膜早破的關(guān)系

凋亡作為一種生理或病理性的細(xì)胞消亡，普遍存在于生物界，機(jī)體通過(guò)凋亡消除衰老的細(xì)胞并代這以新的細(xì)胞，從而維持組織器官中細(xì)胞數(shù)量的穩(wěn)定。細(xì)胞凋亡的發(fā)生受相關(guān)基因蛋白的調(diào)控，其中抑制細(xì)胞凋亡的基因蛋白Bcl-2在細(xì)胞凋亡的分子調(diào)節(jié)中起著重要的作用，它抑制細(xì)胞凋亡，阻止程序細(xì)胞死亡，延長(zhǎng)細(xì)胞生存期。促進(jìn)細(xì)胞凋亡的基因蛋白Bax起著加速細(xì)胞凋亡的作用。一般認(rèn)為，這兩類蛋白質(zhì)的比值決定細(xì)胞在受到凋亡信號(hào)刺激時(shí)否發(fā)生凋亡。Bcl-2/Bax異二聚體的比值在凋亡中起到重要作用，其比值越低，凋亡越明顯[9]。

本研究結(jié)果顯示，Bcl-2與Bax在胎膜上所有細(xì)胞都有表達(dá)，說(shuō)明二者的確參與了胎膜上細(xì)胞凋亡的調(diào)控。在發(fā)生RPOM胎膜組織中Bcl-2的陽(yáng)性表達(dá)率為90%，對(duì)照組為93.3%，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)兩組結(jié)果無(wú)明顯差異（p>0.05），PROM組中Bax的陽(yáng)性率表達(dá)為90%，對(duì)照組為63.3%，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)兩組結(jié)果顯著差異（P<0.005）。這種Bax與Bcl-2的不平衡的表達(dá)結(jié)果，證實(shí)了PROM組的胎膜細(xì)胞凋亡的同時(shí)，也證實(shí)了細(xì)胞內(nèi)Bcl-2與Bax的比例調(diào)節(jié)了凋亡的同時(shí)，也證實(shí)了細(xì)胞內(nèi)Bcl-2與Bax的比較調(diào)節(jié)了凋亡的發(fā)生，當(dāng)Bax過(guò)多不能被結(jié)合時(shí)則會(huì)加速細(xì)胞凋亡。過(guò)度細(xì)胞凋亡可刺激基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPS）的表達(dá)、活化，而MMPS是降解胎膜細(xì)胞外基質(zhì)和膠原纖維的主要蛋白水解酶[10]。在未受產(chǎn)程影響的宮頸口處胎膜明顯弱化，張力度下降，細(xì)胞凋亡和MMPS水平均升高，說(shuō)明細(xì)胞凋亡與MMPS具有協(xié)同作用，促使胎膜組織結(jié)構(gòu)發(fā)生病理改變，最終導(dǎo)致PROM[11]。

本研究中，PROM組Cyt-c的陽(yáng)性表達(dá)率為73.3%，對(duì)照組為43.3%，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)兩組結(jié)果有顯著性差異，從而也證實(shí)了早破胎膜中的細(xì)胞凋亡的增加。由于促凋亡蛋白Bax、Cyt-c陽(yáng)性表達(dá)率均為PROM組高于對(duì)照組，可以推斷在PROM的胎膜中Bax與Cyt-c間存在正相關(guān)關(guān)系，與Korsmeyer等[13]的報(bào)道相一致。

綜上所述，PROM的發(fā)生是多個(gè)相關(guān)因素經(jīng)多種途徑觸發(fā)的多個(gè)基因調(diào)控的胎膜的細(xì)胞外基質(zhì)降解和細(xì)胞凋亡的結(jié)果，進(jìn)一步闡明胎膜早破確切的發(fā)病機(jī)制仍是我們指導(dǎo)防治本病的關(guān)鍵。我們認(rèn)為，PROM中細(xì)胞凋亡的增加導(dǎo)致了胎膜降解的增加，最終導(dǎo)致了胎膜的破裂。本研究證實(shí)，胎膜早破的發(fā)生與Bax、Cyt-c表達(dá)的增強(qiáng)相關(guān)，基因調(diào)控下的胎膜細(xì)胞凋亡增加可能是PROM的一個(gè)重要的發(fā)病機(jī)制，故通過(guò)對(duì)凋亡調(diào)控基因Bax、Cyt-c與RPOM相關(guān)性的研究有助于我們?cè)黾訉?duì)其發(fā)病機(jī)理的認(rèn)識(shí)，其研究可能對(duì)胎膜早破的預(yù)防和治療提供重要的依據(jù)。

參考文獻(xiàn)

[1] 馮妍，其木格.胎膜早破與細(xì)胞凋亡的相關(guān)性研究[J].中外醫(yī)學(xué)研究，2009，7（6）：17-19.

[2] 樂(lè)杰，主編.婦產(chǎn)科學(xué)[M]第6版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2004，145-146.

[3] 許良中，楊文濤.免疫組織化學(xué)反應(yīng)結(jié)果的判斷標(biāo)準(zhǔn)[J].中國(guó)癌癥雜志，1996，6（4）：229-231.

[4] RUNIC R，et al.Apoptosis and Fas expression in human fetal menbrance[J]. Clin Endocrinol Metab，1998，83（3）：660.

[5] 樊廷俊，夏蘭，韓貽仁，等.線粒體與細(xì)胞凋亡[J].生物化學(xué)與生物物理學(xué)報(bào)，2001，33（1）：7-12.

[6] 賴仁勝，周溶，李祥周，等.胎膜早破的生物生理學(xué)機(jī)制探討[J].中華婦產(chǎn)科雜志，1990，28（9）：521-522.

[7] 肖小敏，王自能.肌成纖維細(xì)胞與胎膜早破[J].中華婦產(chǎn)科雜志，1992，27（2）：108.

[8] 李小毛，沈慧敏，侯紅瑛，等.關(guān)于臨產(chǎn)前后胎盤與胎膜中細(xì)胞凋亡的研究[J].中華圍產(chǎn)醫(yī)學(xué)雜志，2003，3（2）：71-72.

[9] 任云青.子宮內(nèi)膜異位癥與細(xì)胞凋亡[J].醫(yī)學(xué)綜述，2005，11（8）：689-694.

[10] 邱曉紅，李荷蓮.基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2、MMP-9及抑制因子TIMP-1、TIMP-2在子宮內(nèi)膜異位癥中的表達(dá)及意義[J].中國(guó)實(shí)用婦科與產(chǎn)科雜志，2004，20（3）：158-160.

[11] 盧宗杰，簡(jiǎn)麗.胎膜早破絨毛膜羊膜bFGG與Bax、Bcl-2的表達(dá)[J].中華圍產(chǎn)醫(yī)學(xué)雜志，2006，9（4）：240-242.