格利特對模擬雞舍環(huán)境中禽流感病毒的殺滅效果

李亞雄　仇正興

摘 要：為驗證在有機物存在下格利特消毒劑殺滅禽流感病毒的能力，試驗?zāi)M雞舍和周圍環(huán)境的消毒實際情況，在雞糞中混入H9亞型禽流感病毒，研究格利特消毒劑（20 %戊二醛溶液）殺滅禽流感病毒的效果，結(jié)果：1∶100、1∶200和1∶400稀釋的格利特消毒劑在4 ℃或25 ℃下作用20 min，均能100 %殺滅混入雞糞中的H9N2禽流感病毒；1∶200稀釋的格利特消毒劑25 ℃下作用 20 min，能殺滅存在于雞糞和清潔劑中的100 %H9N2禽流感病毒。1∶100、1∶200、1∶400、1∶800、1∶1 600稀釋的格利特消毒劑25 ℃下作用20 min，均能100 %殺滅無雞糞保護的H9N2禽流感病毒。結(jié)論：格利特消毒劑能殺滅有雞糞保護的禽流感病毒。

關(guān)鍵詞：消毒劑；模擬環(huán)境；稀釋度；禽流感病毒：殺滅作用

中圖分類號：S851.36 文獻標識碼：A 文章編號：1001-0769（2014）06-0068-02

消毒劑種類繁多，常用的消毒劑以成分分類主要有9種：含氯消毒劑、過氧化物類消毒劑、醛類消毒劑、醇類消毒劑、含碘消毒劑、酚類消毒劑、環(huán)氧乙烷、雙胍類消毒劑和季銨鹽類消毒劑。按消毒效果分類有3種：高效消毒劑、中效消毒劑、低效消毒劑。

不同種類的消毒劑因各自的作用原理和含量差異，具有各自的適用范圍和消毒濃度，超出適用范圍和濃度范圍，消毒效果變差甚至根本不能產(chǎn)生消毒效果。

人和動物疫病時有發(fā)生，預防疫病發(fā)生有三種主要途徑：消滅傳染源、切斷傳播途徑和保護易感者。有的疫病已經(jīng)研制出疫苗，可以使用疫苗保護易感者，但很多為老病新發(fā)（病原發(fā)生了質(zhì)的變異）或新發(fā)傳染病，如2013年2月開始在中國發(fā)生的H7N9禽流感疫情。

預防和控制流感病毒感染的措施主要集中在阻止病毒的入侵和入侵后控制病毒的進一步傳播。流感病毒從呼吸道和消化道排出，污染的糞尿最有可能導致流感在禽群之間傳播。

消滅和減少雞舍和周圍環(huán)境中病原微生物的最好方法是打掃、清洗后（存在少許雞糞）消毒。我們知道：帶有雞糞等有機物的雞舍和周圍環(huán)境中禽流感病毒的殺滅并不是任何一種消毒劑均能奏效。為選擇用于帶有雞糞等有機物雞舍及其周圍環(huán)境中禽流感病毒消毒的消毒劑，我們查閱了有關(guān)資料，《禽病學》第十一版第153頁有如下記載：禽流感病毒（AIV）在一般環(huán)境中的穩(wěn)定性相對較差，通過改變物理因素即可使病毒失活。在有機物存在時，AIV能被化學試劑如醛類、β-丙內(nèi)酯和二乙基亞胺等滅活，除去有機物（消毒劑單獨與AlV作用），則可使用酚類、銨離子、氧化劑（如次氯酸鈉）、稀酸和羥胺來破壞AIV。根據(jù)以上敘述，我們選擇不同稀釋度的格利特消毒劑（20 %戊二醛溶液）來研究醛類消毒劑對AIV的殺滅效果。

1 材料

1.1格利特（GLUTEXTM）戊二醛溶液

規(guī)格 20 %（g/g），批號：YY00D8N001，生產(chǎn)日期：2013年8月23日（有效期：1年）。

1.2 9～10日齡SPF雞胚：

梅里亞維通實驗動物技術(shù)有限公司供應(yīng)；

1.3 病毒

NJ01株H9N2亞型禽流感病毒尿囊液，病毒含量為107.0EID50左右，江蘇省農(nóng)科院獸醫(yī)所家禽重大疫病防控研究室分離、保存。

1.4 立白洗潔精

廣州立白企業(yè)集團有限公司生產(chǎn)，有效期至2014年7月22日。

1.5 0.22μm微孔濾膜過濾器

Millipore Ireland Ltd.產(chǎn)品。

1.6 雞糞便

取自試驗雞場；生理鹽水：自配，pH6.8～7.0；自來水：取自自來水水管，pH6.8～7.0。

1.7 1 %雞紅細胞溶液

實驗室自制，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.8 LB固體培養(yǎng)基

實驗室自制。

1.9其他材料和儀器

固體石蠟、打孔器、離心機、超凈工作臺等。

2 方法

2.1 病毒與消毒劑的稀釋

先將病毒進行1∶1 000稀釋（因為原來的病毒含量為106.5EID50，先1∶1 000稀釋后，接種時只需進行10-1、10-2、10-3稀釋）；將格利特消毒劑用自來水稀釋為1∶33.4、1∶53.3、1∶66.7、1∶133.4、1∶266.7、1∶533.4（v/v）。

2.2雞糞+病毒+消毒劑

取雞糞100 g、病毒溶液100 mL攪拌混勻，分出4份，每份10 mL，其中3份分別加入5 mL 1∶33.4、1∶66.7、1∶133.4稀釋的格利特消毒劑，使雞糞∶病毒溶液∶消毒劑稀釋液比=1∶1∶1，將每份混合液搖勻后均分為2部分，一部分置4 ℃、另一部分置25 ℃下作用，20 min后取出離心過濾。第4份加入5 mL自來水，作為該組不加消毒劑的病毒含量測定對照，25 ℃下作用20 min后取出離心過濾。

2.3 病毒+消毒劑對照

取病毒溶液60 mL，加入60 mL自來水攪拌混勻，分出5份，每份10 mL，其中4份分別加入5 mL 1∶66.7、1∶133.4、1∶266.7、1∶533.4稀釋的格利特消毒劑，使自來水：病毒溶液：消毒劑稀釋液=1∶1∶1。第5份加入5 mL自來水作為病毒+自來水對照。均置25 ℃作用20 min后取出離心過濾。

2.4 雞糞+病毒+清潔劑+消毒劑

取雞糞50 g、病毒溶液50 mL、10 mL l：400稀釋的洗潔精溶液混勻，取出2份，每份11 mL，其中l(wèi)份加入4 mL 1∶53.3稀釋的格利特消毒劑，使雞糞∶病毒溶液∶洗潔精溶液∶消毒劑稀釋液=5∶5∶1∶4。將混合液搖勻后均分為2部分，1份置25 ℃作用，20 min后取出離心過濾。第2份加入4 mL自來水作為該組不加消毒劑的病毒含量測定對照，25 ℃作用20 min后取出離心過濾。

2.5 病毒+生理鹽水對照

取病毒溶液2 mL，加入4 mL生理鹽水混勻，25 ℃作用20 min后取出離心過濾。用于測定病毒在生理鹽水介質(zhì)中的病毒含量，與其它各對照組的病毒含量進行比較。

為了清楚明了，將分組和稀釋結(jié)果概括見表1。

2.6 稀釋、接種和觀察

將以上所有過濾液用滅菌生理鹽水分別進行10-1～10-3 的10倍倍比稀釋。病毒+生理鹽水對照進行10-1～10-6的10倍倍比稀釋，每一份過濾液的各稀釋度均尿囊腔途徑接種3枚SPF雞胚，O.1 mL/枚，置37 ℃溫箱進行孵化，每天上下午各照1次，死肝及時取出，至120 h將活胚取出凍死。

2.7收獲和檢測

無菌收取所有死胚和活胚的尿囊液，測定其血凝價（HA），另對36 h前死肝尿囊液進行無菌檢驗。

2.8病毒含量的計算

根據(jù)雞胚感染情況，計算各過濾液的病毒含量。

2.9消毒效果判定

根據(jù)有消毒劑作用組和無消毒劑對照組的病毒含量測定，判斷消毒劑的消毒效果。

3 結(jié)果

3.1雞胚感染比例

所有處理項的各稀釋度雞胚感染比例見表2，以HA≥ 2 log2判為感染。

3.2 病毒含量

根據(jù)雞胚感染情況，按Reed和Muench法計算出各處理項的病毒含量，結(jié)果見表2。

4 結(jié)論

4.1 通過實驗驗證了《禽病學》第十一版153頁的觀點：在有機物（如雞糞）存在時，AIV

4.2在有雞糞保護的4 ℃或25 ℃下作用20 min，1∶400以下稀釋的格利特消毒劑能夠100 %殺滅雞糞中的AIV。溫度對格利特消毒劑消毒效果的影響很小。

4.3 25 ℃下作用20 min，1∶1 600以下稀釋的格利特消毒劑能夠100 %殺死無雞糞等有機物保護的AlV。

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