高產(chǎn)漆酶菌株獴acillus 玸p. CLb的篩選及其對染料脫色效果的研究

李凡姝等

摘要

[目的] 為了篩選出一株高產(chǎn)漆酶的菌株。[方法]利用含銅的富集培養(yǎng)基從土壤中篩選出漆酶活性較高的菌株，結(jié)合形態(tài)學(xué)、生理生化特性及16S rDNA序列分析對菌株的分類地位進(jìn)行鑒定，研究菌株的生長特性及菌株的芽孢漆酶對常用染料的脫色效果。[結(jié)果]該菌株屬于芽孢桿菌屬，命名為Bacillus sp. CLb。菌株CLb最適生長溫度為37 ℃，最適生長pH為7.0，菌株能在含1 mmol/L Cu2+ 的培養(yǎng)基中生長，具有很強(qiáng)的耐銅性。以丁香醛連氮為底物，測定其芽孢漆酶活性，漆酶活性高達(dá)46.1 U/g干重。菌株CLb芽孢漆酶的最適pH為7.0。在介體乙酰丁香酮存在的脫色體系中，菌株CLb芽孢漆酶在4 h內(nèi)對活性黑以及在2 h內(nèi)對靛紅的脫色率均達(dá)到930%，在6 h內(nèi)對活性亮藍(lán)和結(jié)晶紫脫色率分別為790%和92.5%。[結(jié)論] 菌株CLb芽孢漆酶在介體乙酰丁香酮存在的體系中對常用染料具有很高的脫色率。

關(guān)鍵詞細(xì)菌漆酶；芽孢桿菌屬；染料脫色

中圖分類號S188文獻(xiàn)標(biāo)識碼A文章編號0517-6611（2014）06-01614-03Abstract[Objective] The research aimed to screen a strain with high laccase activity. [Method] Enrichment medium added with copper ions was used to screen bacteria with laccase activity from forest soil. A bacterium highly producinglaccase was identified by morphological， physiological and biochemical characteristics with 16S rDNA sequence analysis. The growth characteristics of the strain and the decolorization effect to dye were researched. [Result] The strain was identified as Bacillus sp. CLb. The optimum growth temperature of strain CLb was 37℃ and the optimum growth pH was 7.0. The strain CLb could grow in culture medium containing 1 mmol/L Cu2+. Its spore laccase activity was 46.1 U/g dry weight used syringaldazine as substrate. The optimum pH of the spore laccase was determined 7.0. When acetosyringone was added to the decolorizing system， its spore laccase could decolorize 93.0%， 93.0%， 79.0% and 92.5% of reactive black 5 in 4 hour， indigo carmine in 2 hour， reactive blue 19 and crystal violet in 6 hour.[Conclusion] The spore laccase of strain CLb could decolorize commonly used dyes well in acetosyringonesystem.

Key words Bacterial laccase； Bacillus； Dye decolorization

漆酶（EC 1.10.3.2， pdiphenol： dioxygen oxidoreductases）是一種含銅的多酚氧化酶，能夠利用分子氧氧化各種芳香族和非芳香族化合物，同時完成多種底物的單電子轉(zhuǎn)移，分子氧被還原為水[1]。漆酶參與生物合成和木質(zhì)素降解。白腐菌漆酶對木質(zhì)素的降解效果較好[2]。因此，真菌漆酶應(yīng)用于木質(zhì)素和纖維材料的修飾及去木質(zhì)素方面有較好的前景。漆酶作用的底物范圍很廣，可應(yīng)用于工業(yè)廢水脫毒、紙漿造紙、紡織業(yè)和石化工業(yè)以及作為生物修復(fù)劑清理除草劑和殺蟲劑[3]。

20世紀(jì)以前，對漆酶的研究主要集中在真菌漆酶[2]，對原核生物中漆酶的研究少有報道。Alexandre等[4]根據(jù)分子數(shù)據(jù)分析，提出漆酶基因可能廣泛存在于細(xì)菌中。自1983年首次發(fā)現(xiàn)原核生物生脂固氮螺菌（Azospirillum lipoferum）具有漆酶活性[5]，隨后陸續(xù)有報道證實海單胞菌（Marinomonas mediterranea）[6]、大腸桿菌（ Escherichia coli ）[ 7]、黃色鏈霉菌（Streptomyces galbus）[8]以及天藍(lán)色鏈霉菌（S.coelicolor）[9]等菌株具有漆酶活性。雖然大多數(shù)細(xì)菌漆酶與真菌漆酶相比產(chǎn)量少且氧化還原電位較低，但是細(xì)菌漆酶具有不需糖基化，具有較好的熱穩(wěn)定性和pH范圍廣泛等優(yōu)點[10]，使得細(xì)菌漆酶比真菌漆酶更適合基因操作和構(gòu)建重組酶[11]。細(xì)菌生長繁殖速度較快，研究周期較短，使得高產(chǎn)漆酶菌株的篩選以及分離鑒定具有高效性。筆者從東北林業(yè)大學(xué)實驗林場樟子松林的土壤中采集樣品，利用含銅的富集培養(yǎng)基篩選出一株高產(chǎn)漆酶的細(xì)菌菌株CLb，通過形態(tài)學(xué)、生理生化特性以及16S rDNA序列分析，將菌株CLb初步鑒定為芽孢桿菌屬，并對菌株的生物學(xué)特性及其對染料的脫色效果進(jìn)行研究，為細(xì)菌漆酶應(yīng)用于染料脫色提供理論基礎(chǔ)。

1.2.4

構(gòu)建菌株CLb的系統(tǒng)發(fā)育樹。將測定的結(jié)果在NCBI的BLAST上搜索比對，利用Clustal軟件進(jìn)行多序列比對，用Phylip3.69軟件中的最大簡約法構(gòu)建該菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.5

菌株CLb的生物學(xué)特性研究。對菌株CLb的生長曲線、最適生長溫度、最適生長pH、耐鹽性以及Cu2+抗性等5個方面進(jìn)行研究。

2 結(jié)果與分析

2.1菌株CLb篩選及其生理生化特性

從篩選的菌株中選取對丁香醛連氮顯紅色最深的一株細(xì)菌CLb進(jìn)行研究。菌株CLb的革蘭氏染色結(jié)果為藍(lán)紫色，是革蘭氏陽性細(xì)菌，細(xì)胞大小為（1 μm～2 μm）×（5 μm～7 μm），短桿狀，有芽孢，具有側(cè)鞭毛和莢膜；在LB固體培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)24 h，菌落乳白色、扁平、呈圓形，菌落表面干燥、光滑，菌落邊緣呈葉狀，菌落不透明且正反顏色一致。

菌株CLb VP試驗呈陽性，甲基紅試驗呈陽性，硝酸鹽還原試驗呈陽性，丙二酸鹽試驗呈陽性。芽孢桿菌CLb可利用麥芽糖、木糖、蔗糖、阿拉伯糖、甘露醇、肌醇、山梨醇、密二糖和乳糖。芽孢桿菌CLb含明膠液化酶、脂肪酶、氧化酶、過氧化氫酶、蛋白酶和尿素酶。

2.3菌株CLb的生長特性

根據(jù)所測OD600數(shù)值，顯示出菌株CLb在1～3 h之間生長緩慢；5～15 h進(jìn)入對數(shù)生長期；25 h后進(jìn)入穩(wěn)定期。由圖2可知，菌株CLb的最適生長溫度為37 ℃，25～42 ℃時該菌株均能生長，但50 ℃下菌株幾乎不能生長。由圖3可知，菌株CLb的最適生長pH為7，pH 5～9菌株CLb生長良好，但是pH為4和11時菌株幾乎不能存活。由圖4可知，菌株CLb的耐鹽性良好，菌株CLb能在NaCl濃度為1%～5%的范圍內(nèi)生長良好， NaCl濃度高于7%時菌株CLb生長緩慢。由圖5可知，菌株CLb對Cu2+的抗性比較強(qiáng)。當(dāng)培養(yǎng)基中Cu3 討論

目前為止，細(xì)菌漆酶在生物技術(shù)上的應(yīng)用越來越廣泛，人們對其關(guān)注也越來越多，但是對其研究還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠，國內(nèi)外對細(xì)菌漆酶的報道相對真菌漆酶還比較少。隨著生物信息學(xué)技術(shù)的發(fā)展，人們發(fā)現(xiàn)越來越多的細(xì)菌具有漆酶活性。其中，最著名的細(xì)菌漆酶當(dāng)屬來源于枯草芽孢桿菌中的CotA蛋白，對其基因序列和催化結(jié)構(gòu)的研究也日趨成熟[14]。

芽孢桿菌屬的漆酶活性來源于芽孢外衣上。漆酶活性的高低與芽孢產(chǎn)量緊密相關(guān)。菌株CLb在LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)5 d，芽孢產(chǎn)量達(dá)到最高，在菌體上滴加濃度1%丁香醛連氮溶液呈深紅色。芽孢漆酶的酶活性可高達(dá)到71.53 U/g干重。雖然細(xì)菌漆酶比真菌漆酶的產(chǎn)量低，不易提取，氧化還原電位低，但是細(xì)菌漆酶有較好的熱穩(wěn)定性和耐堿性[11]。菌株CLb能在pH 5～9下生長，其芽孢漆酶的最適pH為7，而真菌漆酶一般在pH 3～6內(nèi)顯示活性[10]。該研究中篩選出的菌株CLb屬于芽孢桿菌屬，還沒有鑒定到具體的種。由此可見，該菌株為一個新的種，還需要對菌株CLb進(jìn)行全面的鑒定，并且對菌株CLb的芽孢漆酶的酶學(xué)性質(zhì)開展進(jìn)一步的研究。每年有越來越多新合成的染料被應(yīng)用于紡織業(yè)[14]。許多合成染料是有毒的，具有致突變、致癌性，對人類健康有潛在的危害[15]。菌株CLb芽孢對活性黑和靛紅有較好的脫色效果，在4 h以內(nèi)脫色率均達(dá)到93%。其中，靛紅是紡織業(yè)用于印染牛仔褲的染料，使用率非常高。可見，菌株CLb的芽孢漆酶在印染廢水的處理上具有很大的潛力。

安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)2014年

參考文獻(xiàn)

[1]

WIDSTEIN P， KANDELBAUER A. Laccase application in the forest products industry： a review[J]. Enzyme and Microbial Technology， 2008， 42： 293-307.

[2] THURSTON C F. The structure and function of fungal laccases[J]. Microbiology， 1994，140：19-26.

[3] COUTO S R， HERRERA J L T. Industrial and biotechnological applications of laccases： a review[J]. Biotechnology Advances， 2006， 24：500-513.

[4] ALEXANDRE G， ZHULIN I B. Laccases are widespread in bacteria[J]. Trends in Biotechnology， 2000， 18：41-42.

[5] GIVAUDAN A， EFFOSSE A， FAURE D， et al. Polyphenol oxidase in Azospirillum lipoferum isolated from rice rhizosphere： evidence for laccase activity in nonmotile strains of Azospirillum lipoferum[J]. FEMS Microbiology Letters，1993，108（2）： 205-210.

[6] SANCHEZAMAT A， SOLANO F. A pluripotent polyphenol oxidase from the melanogenic marine Alteromonas sp. shares catalytic capabilities of tyrosinases and laccases[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications， 1997， 240： 787-792.

[7] GRASS G， RENSING C. CueO is a multicopper oxidase that confers copper tolerance in Escherichia coli[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications， 2001， 286（5）：902-908.

[8] KUZNETSOV V D， FILIPPOVA S N， RYBAKOVA A M. Nature of the brown pigment and the composition of the phenol oxidases of Streptomyces galbus[J]. Microbiology， 1984， 53：193-197.

[9] MACHCZYNSKI M C， VIJGENBOOM E， SAMYN B， et al. Characterization of SLAC： A small laccase from Streptomyces coelicolor with unprecedented activity[J]. Protein Science， 2004， 13（9）：2388-2397.

[10] BALDRIAN P. Fungal laccasesoccurrence and properties[J]. FEMS Microbiology Reviews， 2006， 30（2）：215-242.

[11] HULLO M F， MOSZER I， DANCHIN A， et al. CotA of Bacillus subtilis is a copperdependent laccase[J]. Bacteriology， 2001， 183（18）：5426-5430.

[12] 東秀珠，蔡妙英.常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊[M].北京： 科學(xué)出版社， 2001：364-399.

[13] GOLDMAN R C， TIPPER D J.Bacillus subtilis spore coats： complexity and purification of an unique polypeptide component[J]. Biotechnology， 1978， 135（3）：1091-1106.

[14] KUDANGA T， NYANHONGO G S， GUEBITZ G M， et al. Potential applications of laccasemediated coupling and grafting reactions： A review[J]. Enzyme and Microbial Technology， 2011， 48：195-208.

[15] CHEQUER F M D， ANGELI J P F， FERRAZ E R A， et al. The azo dyes disperse red 1 and disperse orange increase the micronuclei frequencies in human lymphocytes and in HepG2 cells[J]. Mutation ResearchGenetic Toxicology and Environmental Mutagenesis， 2009， 676（1）：83-86.