紙片法快速檢測水中總大腸菌群方法探討

張振春

【摘要】目的：研究紙片法快速檢測水中總大腸菌群方法。方法：將采集到的水樣，按GB/T5750.12-2006《生活飲用水標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法 微生物指標(biāo)》中多管發(fā)酵法和水中總大腸菌群紙片法同時(shí)測定水中總大腸菌群。結(jié)果：總大腸菌群紙片法快速檢測結(jié)果與國標(biāo)多管發(fā)酵法測定結(jié)果比較無顯著性差異，兩種方法具有較好的相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)為0.9670。結(jié)論：總大腸菌群紙片法與國標(biāo)法相比無顯著性差異，具有一定的可行性，值得推廣。

【關(guān)鍵詞】總大腸菌群；紙片法；快速檢測；多管發(fā)酵法

Abstract：objective: to study the paper method of rapid detection method of total coliform bacteria in water. Methods: water samples were collected, according to GB/T5750.12-2006 "standard of drinking water test method of microbial indicators of multi-tube fermentation and total coliform bacteria in water paper method of determination of total coliform bacteria in water at the same time. Results: the total coliforms paper method Rapid test results compared with the national standard determination of multi-tube fermentation, there was no significant difference of two methods has good correlation, the correlation coefficient of 0.9670. Conclusion: the total coliforms paper method to there was no significant difference compared with national standard method, it has certain feasibility, is worth promoting.

Key words：total coliform bacteria; Pieces of paper; Rapid detection; Multiple tube fermentation

【中圖分類號(hào)】R4【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A【文章編號(hào)】1671-8801（2014）08-0024-02

總大腸菌群是評價(jià)水中糞便污染程度的一個(gè)重要指標(biāo)，目前國家標(biāo)準(zhǔn)方法GB/T5750.12-2006中（1）多管發(fā)酵法（2）濾膜法（3）酶底物法，大多數(shù)主要采用多管發(fā)酵方法，其具有準(zhǔn)確性好、可靠性高、靈敏性好等特點(diǎn)，但是需要做大量的實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備工作且需要較長的時(shí)間才能獲得檢測結(jié)果，試驗(yàn)操作繁瑣，需要進(jìn)行初發(fā)酵，平板分離培養(yǎng)，染色鏡檢和復(fù)發(fā)酵等試驗(yàn)步驟，不適用于對樣品進(jìn)行快速檢測。因此研究水中總大腸菌群快速檢測方法是十分必要的。

紙片法是采用中國疾病預(yù)防控制中心營養(yǎng)與食品安全所監(jiān)制，保定市康達(dá)醫(yī)學(xué)用品研究所研制的大腸菌群快速檢驗(yàn)紙片，具有操作簡單，可直接加入樣品，在16-18小時(shí)內(nèi)可獲得檢測結(jié)果等優(yōu)點(diǎn)，特別適合工作量大，及衛(wèi)生監(jiān)督工作的需要。

1 材料與方法

1.1樣品

實(shí)驗(yàn)樣品來自遼寧省沈陽市康平縣農(nóng)村安全飲水工程中的水源井。

1.2試劑

多管發(fā)酵法：乳糖蛋白胨培養(yǎng)基和伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基均來自杭州天和微生物試劑有限公司，革蘭氏染液試劑來自杭州天和微生物試劑有限公司。

紙片法：紙片是來自保定市康達(dá)醫(yī)學(xué)用品研究所。

1.3儀器

多管發(fā)酵法：試管、發(fā)酵管、500mL滅菌玻璃廣口瓶、滅菌平皿、天平、CX31OLYMPUS顯微鏡(日本株式會(huì)社生產(chǎn))、BSC-1360ⅡA2生物安全柜（北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司）、LMQ.J高壓蒸汽滅菌器（山東新華醫(yī)療器械廠生產(chǎn)）、滅菌吸管、滅菌吸管、載玻片、接種環(huán)和DHP-420S恒溫培養(yǎng)箱（北京永光明醫(yī)療儀器廠）。

紙片法：試管、BSC-1360ⅡA2生物安全柜（北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司）、LMQ.J高壓蒸汽滅菌器（山東新華醫(yī)療器械廠生產(chǎn)）、滅菌吸管、DHP-9162

恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒科技有限公司）。

1.4采樣方法

用500mL滅菌玻璃瓶取水樣封口編號(hào)送實(shí)驗(yàn)室檢測。

1.5檢測方法

1.5.1多管發(fā)酵法（國標(biāo)法）：按GB/T5750.12-2006中 2.1.5具體操作步驟如下：

（1）乳糖發(fā)酵試驗(yàn):取10mL水樣接種到10mL雙料乳糖蛋白胨培養(yǎng)液中，取1mL水樣接種到10mL單料乳糖蛋白胨培養(yǎng)液中，另取1mL水樣注入到9滅菌生理鹽水中，混勻后吸取1mL注入到10mL單料乳糖蛋白胨培養(yǎng)液中，每一稀釋度接種5管。將接種管置36℃培養(yǎng)箱內(nèi)，培養(yǎng)24小時(shí)，如所有乳糖蛋白胨培養(yǎng)管都不產(chǎn)氣產(chǎn)酸則可報(bào)告為總大腸菌群陰性，如有產(chǎn)酸產(chǎn)氣者，則按下列步驟進(jìn)行。

（2）分離培養(yǎng)：將產(chǎn)酸產(chǎn)氣的發(fā)酵管分別接種在伊紅美藍(lán)瓊脂平板上，于36℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24小時(shí)，觀察菌落形態(tài)，挑取符合下列特征的菌落作革蘭氏染色、鏡檢和證實(shí)試驗(yàn)。

深紫黑色、具有金屬光澤的菌落；

紫黑色、不帶或略帶金屬光澤的菌落；

淡紫紅色、中心較深的菌落。

（3）證實(shí)試驗(yàn)：經(jīng)上述染色鏡檢為革蘭氏陰性無芽孢桿菌，同時(shí)接種乳糖蛋白胨培養(yǎng)液，置36℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)，有產(chǎn)酸產(chǎn)氣者，即證實(shí)有總大腸菌群存在。

根據(jù)證實(shí)為總大腸菌群陽性的管數(shù)，查MPN檢索表，報(bào)告每100mL水樣中的總大腸菌群最可能數(shù)（MPN）值。如所有乳糖發(fā)酵管均陰性時(shí)，可報(bào)告總大腸菌群未檢出。

1.5.2紙片法：

5袋大紙片每袋用無菌吸管各接種水樣10mL；10袋小紙片其中5袋接種水樣各1mL,另5袋接種1：10水樣稀釋液各1mL,總接種量為55.5mL。將接種好的紙片置于37℃恒溫培養(yǎng)箱16-18小時(shí)取出觀察結(jié)果。紙片保持藍(lán)紫色不變或在藍(lán)紫色背景上呈現(xiàn)紅色菌落但紅色菌落周圍無黃暈為大腸菌群陰性紙片，紙片出現(xiàn)紅色菌落其周圍有黃暈或黃色背景下呈現(xiàn)紅色菌落或片狀紅暈為大腸菌群陽性。記錄陽性紙片袋數(shù)根據(jù)大腸菌群MPN檢索表報(bào)告。

2 結(jié)果

表1 多管發(fā)酵法和紙片法檢測結(jié)果（MPN/100mL）

樣品編號(hào) 多管發(fā)酵法 紙片法 樣品編號(hào) 多管發(fā)酵法 紙片法

100 1100

245 1222

300 1368

4 19 17 14 12 10

5 11 13 1522

6 221644

7 441767

8 25 29 189 11

9 17 17 197 6

1000209 9

計(jì)算統(tǒng)計(jì)值t=0.154，查t0.05=2.021，t

為了進(jìn)一步研究兩種方法的相關(guān)性，將表1中的兩種方法測定結(jié)果做圖，以紙片法測定結(jié)果為縱坐標(biāo)，以多管發(fā)酵法測定結(jié)果為橫坐標(biāo)，如圖1所示。從圖1中可見兩種方法測定結(jié)果呈線性相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.9670。

圖1 多管發(fā)酵法和紙片法測定結(jié)果相關(guān)性分析

3 討論

水中總大腸菌群檢測數(shù)據(jù)表明：紙片法快速檢測結(jié)果在多管發(fā)酵法檢測的結(jié)果的±10%之內(nèi)波動(dòng)，經(jīng)t檢驗(yàn)兩種方法沒有顯著性差異。兩種方法有較好的相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)為0.9670，這表明總大腸菌群快速檢測法應(yīng)用于水中總大腸菌群的測定具有一定的可行性。

總大腸菌群快速檢測法相對于傳統(tǒng)的多管發(fā)酵法具有明顯優(yōu)點(diǎn):方法簡單易懂，工作人員不需要特殊培訓(xùn)；操作過程簡便易學(xué)，不需要太多的儀器；檢測時(shí)間短，無需確認(rèn)試驗(yàn)，能夠較快捷、準(zhǔn)確地檢測水中總大腸菌群。

參考文獻(xiàn)：

[1]GB/T5750.12-2006. 生活飲用水標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法 微生物指標(biāo)。