妊娠期糖尿病胎鼠心臟發(fā)育過(guò)程中鋅指轉(zhuǎn)錄因子GATA結(jié)合蛋白4 的變化規(guī)律

黎旻

近幾年的流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，妊娠期糖尿病的發(fā)病率呈現(xiàn)逐年升高的趨勢(shì)，且在妊娠期出現(xiàn)糖尿病會(huì)對(duì)胎兒的發(fā)育健康造成嚴(yán)重的影響，比較常見(jiàn)的為巨大兒、先天畸形甚至死胎[1]。有學(xué)者指出，妊娠期糖尿病可導(dǎo)致胎兒心臟畸形，從而嚴(yán)重影響胎兒的生長(zhǎng)發(fā)育。研究顯示[2]，鋅指轉(zhuǎn)錄因子GATA結(jié)合蛋白4 同心臟發(fā)育之間存在明顯的相關(guān)性，為心臟發(fā)育過(guò)程中一個(gè)相對(duì)敏感的調(diào)控因子[3-4]。本研究對(duì)妊娠期糖尿病胎鼠心臟發(fā)育過(guò)程中鋅指轉(zhuǎn)錄因子GATA結(jié)合蛋白4 的變化規(guī)律進(jìn)行分析探討，對(duì)妊娠期糖尿病SD鼠和妊娠非糖尿病鼠進(jìn)行心臟GATA-4 mRNA水平檢測(cè)，并對(duì)比分析檢測(cè)結(jié)果，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 研究裝研究對(duì)象為F級(jí)健康成年SD雌鼠50只、體質(zhì)量(221±19)g，將其隨機(jī)分成對(duì)照組與觀察組，質(zhì)量198～236 g，平均為（219±22）g，所有雌鼠均購(gòu)于廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)為SCXK(粵)2008—0002，粵監(jiān)證字為2008 A 020。

1.2 方法

1.2.1 研究方法 將以上兩組研究鼠進(jìn)行人工受孕后，觀察組造模致妊娠糖尿病，并在受孕后12、15、19 d后行心臟解剖，對(duì)GATA-4 mRNA水平進(jìn)行檢測(cè)，而后對(duì)比分析兩組檢測(cè)結(jié)果。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)方法 所需試劑包括有：濃度為2%的鏈脲佐菌素、GATA-4 抗體、Trizol提取液、SYBR Green熒光定量PCR試劑盒、HRP標(biāo)記的CAPDH、蛋白樣品試劑盒。首先將上述50只SD鼠進(jìn)行人工受孕，觀察組經(jīng)腹腔注射濃度為2%的鏈脲佐菌素，造模致妊娠期糖尿病，而對(duì)照組則給予腹腔注射相同劑量的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液[5-7]。給藥后3 d內(nèi)對(duì)兩組研究鼠實(shí)施監(jiān)測(cè)血糖，并在受孕后的12、15 d 以及19 d后解剖取胎鼠心臟組織，經(jīng)HE染色后對(duì)心臟發(fā)育情況進(jìn)行觀察，并作對(duì)比。

取新鮮的胎鼠心臟組織，給予500 μlRIPA裂解液后，在勻漿器上進(jìn)行反復(fù)碾碎，并經(jīng)離心處理提取總蛋白，依照試劑盒說(shuō)明書(shū)對(duì)總蛋白展開(kāi)初步定量，而后取含有蛋白的10 μl溶液上樣，加入樣品處理液后，煮沸，經(jīng)SDS-PAGE電泳，持續(xù)時(shí)間為2 h，而后轉(zhuǎn)移至PVDF膜，在室溫下經(jīng)濃度為5%的脫脂奶粉進(jìn)行1 h的封閉，洗膜后加Ⅰ抗后在4℃條件下孵育過(guò)夜，經(jīng)TBST洗膜3 次，而后加入Ⅱ抗，室溫下孵育1 h后經(jīng)TBST洗膜3 次，將化學(xué)熒光發(fā)光底物涂抹在膜表面，持續(xù)5 min后將膜表面的殘夜去除，放置在曝光盒中進(jìn)行曝光、顯影以及定影[8]。對(duì)所得相關(guān)資料數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，并展開(kāi)統(tǒng)計(jì)分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 18.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 觀察組與對(duì)照組胎鼠心臟畸形發(fā)生率比較 在受孕后19 d解剖的10 只鼠中，觀察組中發(fā)生胎鼠心臟畸形者4 只（40.0%），對(duì)照組發(fā)生胎鼠心臟畸形者1 例（10.0%），觀察組畸形發(fā)生率較對(duì)照組高（P<0.05）。

2.2 觀察組與對(duì)照組GATA-4 mRNA水平比較 在受孕后15 d后胎鼠心臟組織中GATA-4 mRNA水平最高，均高于12、19 d時(shí)檢測(cè)結(jié)果（P<0.05），且觀察組各時(shí)間段的檢測(cè)結(jié)果均較對(duì)照組發(fā)生明顯降低（P<0.05）。見(jiàn)表1。

表1 觀察組與對(duì)照組GATA-4 mRNA水平比較（±s）

表1 觀察組與對(duì)照組GATA-4 mRNA水平比較（±s）

注：與本組受孕后15 d比較，aP<0.05

組別 受孕12 d 受孕15 d 受孕19 d對(duì)照組 1.16±0.03 a 1.55±0.12 0.91±0.02 a觀察組 0.82±0.01 1.21±0.08 0.70±0.03 t值 13.2212 13.9824 13.7624 P值 0.0187 0.0136 0.0158

3 討論

妊娠糖尿病是指在妊娠后首次出現(xiàn)或者發(fā)病的糖尿病，經(jīng)流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，在糖尿病孕婦中有80%以上者屬于妊娠糖尿病。有研究證實(shí)，妊娠糖尿病會(huì)對(duì)母親健康以及胎兒的發(fā)育產(chǎn)生十分嚴(yán)重的影響，會(huì)造成胚胎期心血管畸形[9]。目前關(guān)于妊娠糖尿病的發(fā)病機(jī)制還不是十分清楚。有學(xué)者指出[10]，高血糖會(huì)利用諸多的生物化學(xué)機(jī)制的誘導(dǎo)而對(duì)人體造成損害，其中以高血糖誘發(fā)線粒體活性氧簇最為顯著，并且，妊娠糖尿病的發(fā)生還會(huì)受遺傳、免疫等因素的影響。

流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示[11]，妊娠期糖尿病會(huì)造成吸收胎、死胎、畸形胎、巨大兒等諸多的發(fā)育異常。在造成心臟畸形中，會(huì)導(dǎo)致心室流出道梗阻、室間隔缺損、室間隔裂、心腔擴(kuò)大、肌壁肥厚等[12]。本研究中，在受孕后15 d后胎鼠心臟組織中GATA-4 mRNA水平最高，均高于12、19 d時(shí)檢測(cè)結(jié)果（P<0.05），且觀察組各時(shí)間段的檢測(cè)結(jié)果均較對(duì)照組發(fā)生明顯降低（P<0.05），可見(jiàn)，本研究在采用2%STZ腹腔注射已受孕的SD雌鼠成功建立GDM模型鼠基礎(chǔ)上，觀察組中吸收胎、死胎、畸心胎、巨大胎兒等發(fā)育異常例數(shù)較對(duì)照組明顯提升；且觀察組胎鼠心臟發(fā)育異常，即包括心室流出道梗阻、室間隔缺損及室間隔裂、肌壁肥厚、心腔擴(kuò)大等發(fā)生率均較對(duì)照組明顯增加，這與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[13]的妊娠糖尿病確實(shí)會(huì)誘發(fā)心臟發(fā)育異常結(jié)果一致。

研究證實(shí)，GATA-4 參與了整個(gè)心臟發(fā)育過(guò)程中，為十分重要的一種轉(zhuǎn)錄因子，使心臟正常發(fā)育所必需的一種物質(zhì)，會(huì)對(duì)諸多的心臟轉(zhuǎn)錄基因表達(dá)進(jìn)行有效的調(diào)控，同時(shí)會(huì)利用鋅指結(jié)果同其它的心臟轉(zhuǎn)錄因子發(fā)生相互作用。GATA-4 主要[14]在胚胎期的心臟、肝臟、性腺以及內(nèi)胚層表達(dá)，同其他的因子發(fā)生協(xié)同作用，對(duì)心原細(xì)胞的特異性分化等進(jìn)行控制，目前關(guān)于GATA-4對(duì)妊娠糖尿病胎鼠心臟發(fā)育的影響還不是十分清楚，曾有相關(guān)文獻(xiàn)指出其為導(dǎo)致胎鼠心臟發(fā)育異常的主要因素[15]。本研究對(duì)50 只人工受精的雌鼠進(jìn)行GATA-4 mRNA水平監(jiān)測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，妊娠糖尿病的觀察組中胎鼠心臟畸形的發(fā)生率較對(duì)照組高，且GATA-4 mRNA水平較對(duì)照組發(fā)生明顯的降低，由此可知，GATA-4 mRNA水平低表達(dá)會(huì)對(duì)胎鼠心臟發(fā)育產(chǎn)生一定程度的影響。

曾有學(xué)者經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)[15]，在高血糖的環(huán)境下，大鼠的心肌細(xì)胞中GATA-4 蛋白含量會(huì)發(fā)生明顯降低，并且經(jīng)STZ所誘導(dǎo)的糖尿病模型鼠心臟組織中GATA-4 水平也明顯降低，GATA-4過(guò)度表達(dá)也可以對(duì)高血糖所引起的心肌細(xì)胞死亡等作用進(jìn)行抑制，由此可以證實(shí)GATA-4 蛋白降解的增加為誘發(fā)高血糖致心臟畸形的一個(gè)主要因素。

綜上所述，作為多種心臟基因表達(dá)的調(diào)控因子，GATA-4 為妊娠糖尿病致心臟發(fā)育異常的一個(gè)重要機(jī)制，這一結(jié)果對(duì)于今后的妊娠糖尿病胎兒發(fā)育研究具有重要的臨床意義。

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