利用ESI－Q－TOF－MS／MS區(qū)分人參皂苷Rh2和CK

孫靖輝，吳 巍，郭迎迎，秦秋杰，劉淑瑩，3

（1.長春中醫(yī)藥大學(xué)，吉林省人參科學(xué)研究院，吉林 長春 130117；2.北華大學(xué)藥學(xué)院，吉林 吉林 132013；3.中國科學(xué)院長春應(yīng)用化學(xué)研究所，長春質(zhì)譜中心，吉林 長春 130022）

人參是五加科植物人參（Panax ginseng C.A.Meyer）的干燥根，應(yīng)用于臨床已有2000多年的歷史，其主要的活性成分是人參皂苷［1］。目前，已鑒定的50多種人參皂苷存在多種同分異構(gòu)體，其中二醇型人參皂苷Rh2和Compound K（CK）屬于稀有人參皂苷同分異構(gòu)體［2］。人參皂苷Rh2具有很好的抗腫瘤和抗疲勞等藥理作用［3－4］，但只少量存在于紅參和野山參中；而 CK在天然人參中并不存在，是二醇型人參皂苷在人體腸道內(nèi)的代謝產(chǎn)物，被認(rèn)為是二醇型人參皂苷在體內(nèi)發(fā)揮藥理作用的主要活性成分，具有抗腫瘤和增強(qiáng)免疫力等功效［5－6］。

鑒于人參皂苷Rh2和CK良好的藥理活性，大量研究力圖通過酶法或微生物法將天然二醇型人參皂苷轉(zhuǎn)化為此兩種稀有皂苷［7－11］；同時，在二醇型人參皂苷體內(nèi)代謝的研究中發(fā)現(xiàn)，人參皂苷Rh2和CK均可通過不同的途徑生成［12－14］，因此二者的區(qū)分鑒定顯得尤為重要。近年來，液相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)廣泛用于復(fù)雜體系中人參皂苷的分析研究［15－18］，且電噴霧－四極桿－飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜（ESI－Q－TOF－MS／MS）技術(shù)因其快捷、準(zhǔn)確的特點(diǎn)已用于人參皂苷的結(jié)構(gòu)鑒定與區(qū)分［19－21］。本工作擬采用 ESI－Q－TOF－MS／MS技術(shù)對人參皂苷的同分異構(gòu)體Rh2和CK進(jìn)行區(qū)分鑒定，旨在為人參皂苷同分異構(gòu)體的快速鑒定分析提供方法參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

6520Q－TOF MS質(zhì)譜儀:美國Agilent公司產(chǎn)品，配有雙噴霧ESI源和自動校準(zhǔn)系統(tǒng)；人參皂苷Rh2和CK標(biāo)準(zhǔn)品（純度＞98%）:由吉林大學(xué)提供；甲醇（色譜純）:美國Tedis公司產(chǎn)品；實(shí)驗(yàn)用水:由Milli－Q超純水機(jī)制備，美國Millipore公司產(chǎn)品。

實(shí)驗(yàn)前，人參皂苷Rh2和CK均配制成濃度為1×10－6g／L的甲醇水溶液［l1］（80∶20，V／V）［12］。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

采用電噴霧（ESI）正離子和負(fù)離子模式；質(zhì)量掃描范圍m／z100～2200；干燥氣（N2）流速:8.0L／min；干燥氣溫度:350℃；霧化氣壓力:255kPa；毛細(xì)管電壓:3.5kV；裂解電壓:175 V；錐孔電壓:65V。

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Masshunter Qualitative Analysis（B.03.01）分析軟件處理；量化計算使用Gaussiian 09軟件，選用B3LYP方法；結(jié)構(gòu)優(yōu)化和鍵能的計算在6－31G（d）基組水平上完成。

2 結(jié)果與討論

人參皂苷Rh2和CK的結(jié)構(gòu)示于圖1，Rh2和CK的一級全掃描質(zhì)譜圖示于圖2。在負(fù)離子模式下，二者均給出準(zhǔn)分子離子［M－H］－m／z621.44；在正離子模式下，二者則均給出加鈉離子［M＋Na］＋m／z 645.43。但是，在一級全掃描質(zhì)譜圖中很難將二者進(jìn)行區(qū)分，因此采用串聯(lián)質(zhì)譜法 （MS／MS）對二者進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析。發(fā)現(xiàn)二者在負(fù)離子和正離子模式下的裂解規(guī)律不同，其串聯(lián)質(zhì)譜圖分別示于圖3、圖4，可以由此對這兩個化合物進(jìn)行區(qū)分鑒定。

圖1 人參皂苷Rh2和CK的結(jié)構(gòu)圖Fig.1 Structures of ginsenoside Rh2and CK

由圖3可見，在負(fù)離子模式下，對人參皂苷Rh2和CK進(jìn)行MS／MS研究，均產(chǎn)生特征碎片離子m／z459［M－glu－H］－和m／z161［glu－H］－。碎片離子m／z 459［M－glu－H］－是準(zhǔn)分子離子［M－H］－脫去葡萄糖殘基（162u）產(chǎn)生的二醇型人參皂苷苷元離子，相應(yīng)的葡萄糖殘基離子m／z 161［glu－H］－也在譜圖中顯示。分析發(fā)現(xiàn)，二者產(chǎn)生的碎片離子種類基本一致，但是豐度不同。為了更好的觀察二者在碎片離子豐度上的區(qū)別，采用不同的碰撞能量進(jìn)行MS／MS研究。從圖3a、3d可以看出，當(dāng)碰撞能量為15eV時，Rh2未發(fā)生裂解，而CK則產(chǎn)生碎片離子m／z459和m／z161；隨著碰撞能量的增加，在25eV和35eV時，Rh2也發(fā)生裂解，但在相同的碰撞能量下，其碎片離子的豐度小于CK。

圖2 人參皂苷Rh2和CK在負(fù)離子（a）和正離子（b）模式下的一級全掃描質(zhì)譜圖Fig.2 MS spectrum of ginsenoside Rh2and CK in negative ion mode（a）and positive ion mode（b）

在正離子模式下，人參皂苷Rh2和CK的MS／MS碎裂特征差異更為明顯，其串聯(lián)質(zhì)譜圖示于圖4。由圖4可見，在碰撞能量分別為20、40、60eV時，CK均產(chǎn)生了特征碎片離子m／z 465［M－glu－H2O＋Na］＋和m／z 203［glu＋H2O＋Na］＋，它們分別是脫水的二醇型人參皂苷苷元和葡萄糖的鈉加合離子；而Rh2在碰撞能量分別為20、40eV時，未產(chǎn)生明顯的特征碎片離子，碰撞能量提高到60eV時，產(chǎn)生豐度較低的特征碎片離子m／z465和m／z203。

以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在負(fù)離子和正離子模式下，Rh2的C3位糖基取代不易發(fā)生斷裂，而CK的C20位糖基取代較易發(fā)生斷裂。采用Gaussiian 09軟件，選用B3LYP方法，在6－31G（d）基組水平上進(jìn)行Rh2和CK結(jié)構(gòu)優(yōu)化和鍵能計算。量化計算的結(jié)果顯示，Rh2的C3位碳氧鍵的鍵能為354.6977kJ／mol，而CK的C20位碳氧鍵的鍵能為347.8709kJ／mol，這表明C20位比C3位化學(xué)性能活潑，所連接的取代葡萄糖易發(fā)生斷裂，這一結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)串聯(lián)質(zhì)譜的研究結(jié)果一致。文獻(xiàn)研究結(jié)果還表明，在串聯(lián)質(zhì)譜中，人參皂苷C20位所連接的糖苷鍵比C3位所連接的糖苷鍵易發(fā)生斷裂［22－23］。

圖3 在負(fù)離子模式、不同碰撞能量下，人參皂苷Rh2和CK的串聯(lián)質(zhì)譜圖Fig.3 MS／MS spectra of ginsenoside Rh2and CK from different collision energy in negative ion mode

圖4 在正離子模式下，人參皂苷Rh2和CK的串聯(lián)質(zhì)譜圖Fig.4 MS／MS spectra of ginsenoside Rh2and CK in positive ion mode

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用ESI－Q－TOF－MS／MS技術(shù)對人參皂苷的同分異構(gòu)體Rh2和CK進(jìn)行串聯(lián)質(zhì)譜分析，發(fā)現(xiàn)二者在負(fù)離子模式下的裂解規(guī)律基本一致。在碰撞能量大于15eV時，均能產(chǎn)生二醇型人參皂苷苷元和一分子葡萄糖殘基的碎裂離子；但在相同碰撞能量下，CK的碎片離子豐度高于Rh2。在正離子模式下，CK在碰撞能量為20、40、60eV 時，均出現(xiàn)碎片離子 m／z 465和m／z203；而Rh2只在較高的碰撞能量（60eV）時出現(xiàn)該特征碎片離子。該方法能夠快速、準(zhǔn)確地區(qū)分和鑒定人參皂苷Rh2和CK，尤其在正離子模式下二者的差異更為明顯，這可為人參皂苷同分異構(gòu)體的快速鑒定分析提供方法參考。

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