三七渣發(fā)酵生產(chǎn)蛋白飼料的菌體生長動力學(xué)

譚顯東 胡 偉 段婭寧 王君君 羊依金

(成都信息工程學(xué)院資源環(huán)境學(xué)院，成都 610225)

通過固態(tài)發(fā)酵技術(shù)將中藥渣轉(zhuǎn)變?yōu)榈鞍罪暳?，可以實現(xiàn)中藥渣的完全利用，這為中藥渣的資源化開辟了一條新的道路［1］。由于進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵過程參數(shù)的測量十分困難，已有的研究工作主要圍繞各種藥渣發(fā)酵工藝條件的優(yōu)化展開［2～6］，對相關(guān)體系發(fā)酵動力學(xué)的研究少見報道。而發(fā)酵動力學(xué)是生化反應(yīng)工程的基礎(chǔ)內(nèi)容之一，以研究發(fā)酵過程的反應(yīng)速率和環(huán)境因素對速率的影響為主要內(nèi)容。通過發(fā)酵動力學(xué)的研究，可進(jìn)一步了解微生物的生理特征，菌體生長和產(chǎn)物形成的合適條件，以及各種發(fā)酵參數(shù)之間的關(guān)系。固態(tài)發(fā)酵過程數(shù)學(xué)模型既可以用于指導(dǎo)生物反應(yīng)器的放大設(shè)計，也可以用于對整個發(fā)酵過程的調(diào)控，是發(fā)酵過程優(yōu)化研究的核心內(nèi)容。

微生物是發(fā)酵培養(yǎng)過程的主體，固態(tài)發(fā)酵過程數(shù)學(xué)模型的開發(fā)依賴于微生物生長動力學(xué)過程的準(zhǔn)確模擬，也直接影響著對固態(tài)發(fā)酵過程的精確調(diào)控。因此，開展了三七渣固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)蛋白飼料的菌體生長動力學(xué)研究。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

產(chǎn)朊假絲酵母(Candida utilis 2.281):四川大學(xué)建筑與環(huán)境學(xué)院;黑曲霉(Aspergillus niger sp.):山東農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院;三七渣(其中粗蛋白、淀粉、真蛋白的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為12.28%、33.13%、9.97%):四川省某中成藥廠;葡萄糖、硫酸銨、乙酸、乙酸鈉、乙醇、瓊脂:成都市科龍化工試劑廠。

QYC－211型恒溫振蕩器:上海?，攲嶒炘O(shè)備有限公司;PYX－280M－C型電熱恒溫培養(yǎng)箱:廣東韶關(guān)科力實驗儀器有限公司;SAL－T11型Labswiftaw便攜式水分活度測定儀:瑞士NOVASINA公司;UV－2550型紫外可見光光度計:SHIMADZU公司;KDN－08C型定氮儀:上海華睿儀器有限公司;7200型分光光度計:尤尼柯(上海)儀器有限公司。

1.2 培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基:馬鈴薯浸取液1.0 L，葡萄糖20.0 g，瓊脂15.0 g，pH 自然，121 ℃ 滅菌 20 min，用于黑曲霉的培養(yǎng)。

土豆汁液體培養(yǎng)基:馬鈴薯浸取液1.0 L，葡萄糖20.0 g，pH 自然，121 ℃滅菌 20 min，用于產(chǎn)朊假絲酵母的培養(yǎng)。

固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基:在10.0 g經(jīng)過預(yù)處理的三七渣中加入0.50 g硫酸銨，培養(yǎng)基含水量70%。于121℃滅菌30 min，用于菌體生長動力學(xué)試驗。

1.3 試驗方法

1.3.1 三七渣的預(yù)處理

三七渣濕物料經(jīng)自然晾曬風(fēng)干后于60℃干燥72 h、粉碎、過60目篩后置于干燥器中備用。

1.3.2 種子液的制備

黑曲霉采用PDA平板培養(yǎng)基在30℃下于電熱恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)3.5 d后刮下，將其制成濃度為2×107個/mL的孢子懸液;產(chǎn)朊假絲酵母采用土豆汁液體培養(yǎng)基在30℃下于電熱恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)18 h，制成濃度為2×107個/mL的菌懸液。

1.3.3 菌體生長動力學(xué)試驗

取126個容量為250 mL的錐形瓶，每個錐形瓶中裝入含10.0 g干三七渣的固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基，將其在121℃滅菌30 min，冷卻后同步接入1.0 mL黑曲霉孢子懸液和1.0 mL產(chǎn)朊假絲酵母菌懸液，然后在30℃條件下進(jìn)行恒溫培養(yǎng)，培養(yǎng)時間為10 d。試驗開始后，每隔12 h(含0時刻)取出6個錐形瓶進(jìn)行相關(guān)參數(shù)的分析測試:從其中3個錐形瓶中分別取出1.00 g發(fā)酵培養(yǎng)物濕物料作為平行樣用于酶活的測試，然后將這3個錐形品中剩余的發(fā)酵培養(yǎng)物在80℃條件下烘干至恒重后作為平行樣用于提取核酸，并測試核酸提取液的吸光度;另外3個錐形瓶中的發(fā)酵培養(yǎng)物在80℃條件下烘干至恒重進(jìn)行稱量。

所有試驗數(shù)據(jù)均為3個平行樣的平均值。

1.3.4 分析方法

1.3.4.1 真蛋白的測定

發(fā)酵培養(yǎng)物需要在80℃條件下烘48 h，再磨碎后取樣，然后先將樣品進(jìn)行醇洗預(yù)處理去除其中的無機氮［7］，再采用凱氏定氮法測定［8］。

1.3.4.2 粗酶液的提取及酶活的測定

準(zhǔn)確稱取1.00 g發(fā)酵培養(yǎng)物(濕基)，將其溶于pH=4.6的50 mL 0.2 mol/L乙酸－乙酸鈉緩沖液中，在40℃恒溫空氣浴中振蕩浸提1 h，然后經(jīng)4層紗布過濾后，將濾液在5 000 r/min條件下離心10 min，取上清液制成粗酶液，置于冰箱中待用。

FPA酶活參照文獻(xiàn)［9］、淀粉酶活參照文獻(xiàn)［10］提供的方法進(jìn)行測定。

1.3.4.3 水分活度測定

采用Labswift－aw便攜式水分活度測定儀。

1.3.4.4 水分含量測定

將發(fā)酵后的培養(yǎng)物連同錐形瓶一起稱重，減去錐形瓶自身的質(zhì)量后可得到發(fā)酵培養(yǎng)物的濕重W1，再將發(fā)酵后的培養(yǎng)物連同錐形瓶一起放入80℃的烘箱中烘干至恒重，將其置于干燥器中冷卻至室溫后再稱重后可以計算得到發(fā)酵培養(yǎng)物的干重W2。水含量可以通過下列公式計算:

1.3.4.5 菌體的生長情況的測定

參照文獻(xiàn)［11］，通過測定發(fā)酵培養(yǎng)物核酸提取液在260 nm處的OD值來間接反映菌體的生長情況。

1.4 建立數(shù)學(xué)模型的方法

由于對數(shù)模型的數(shù)學(xué)表達(dá)形式相對簡單:只需要用一個方程就能夠近似表示包括適應(yīng)期、對數(shù)生長期和穩(wěn)定期在內(nèi)的生長曲線，因此在固態(tài)發(fā)酵動力學(xué)研究中得到了廣泛的應(yīng)用［12］。在本研究中采用絲狀真菌和酵母菌進(jìn)行混菌發(fā)酵，由于菌絲體會滲透到固態(tài)基質(zhì)之中，與基質(zhì)緊密的纏結(jié)在一起，再加上微生物代謝分泌的各種水解酶類也是目標(biāo)產(chǎn)物，因此很難進(jìn)行菌體的直接測量。相關(guān)研究［13］發(fā)現(xiàn)發(fā)酵過程中干物質(zhì)減重率和菌體細(xì)胞的濃度存在線性關(guān)系，這樣就可以用宏觀的干物質(zhì)減重率來間接地描述菌體的生長，用于指導(dǎo)過程設(shè)計和放大［14－15］。干物質(zhì)減重率X(%)定義如下:

式中:m0為t=0時發(fā)酵底物的干基質(zhì)量/g;mt為t時刻發(fā)酵培養(yǎng)物的干基質(zhì)量/g。

相應(yīng)的菌體生長動力學(xué)方程數(shù)學(xué)表達(dá)式如下:積分后可得

式中:X為t時刻干物質(zhì)減重率/%;Xm為最大干物質(zhì)減重率/%;X0為t=0時干物質(zhì)減重率/%;μ為比生長速率常數(shù)/h－1;t為發(fā)酵時間/h。

本次研究采用Origin 8.0軟件內(nèi)置的Slogistic3標(biāo)準(zhǔn)曲線模型對發(fā)酵過程中X－t的關(guān)系進(jìn)行非線性擬合，建立了菌體生長動力學(xué)模型。

2 結(jié)果與討論

2.1 三七渣發(fā)酵過程動態(tài)分析

2.1.1 真蛋白含量及產(chǎn)率系數(shù)的動態(tài)變化

發(fā)酵培養(yǎng)物真蛋白含量及產(chǎn)率系數(shù)的動態(tài)變化如圖1所示。

由圖1可以看出，發(fā)酵培養(yǎng)物的真蛋白含量隨發(fā)酵時間的延長不斷增長，達(dá)到峰值后，又逐漸下降，最后趨于穩(wěn)定。在采用采用黑曲霉固態(tài)發(fā)酵米糠［16］、好食鏈孢霉(Neurospora sitophila)發(fā)酵麩皮［17］以及采用青霉(Penicillium)、根霉(Rhizopus)、木霉(Trichoderma spp.)發(fā)酵蔓越莓廢渣［18］的研究中發(fā)酵培養(yǎng)物中蛋白含量變化趨勢與本次研究相似。由圖1還可以看出，真蛋白產(chǎn)率系數(shù)(指投入單位質(zhì)量的發(fā)酵底物經(jīng)過一段時間的發(fā)酵后所能收獲的真蛋白質(zhì)量)隨時間的變化趨勢則有所不同，在0～36 h期間，真蛋白產(chǎn)率系數(shù)逐漸增大，特別是在12～36 h期間，真蛋白產(chǎn)率系數(shù)的增加速度是整個發(fā)酵周期中最快的，這一階段對真蛋白凈增長貢獻(xiàn)最大;在隨后的108 h(第36～144 h)期間，真蛋白產(chǎn)率系數(shù)在0.132～0.138 g真蛋白/g干三七渣之間波動，基本維持穩(wěn)定，這一階段對真蛋白凈增長幾乎沒有貢獻(xiàn)，但是在這一階段，微生物通過呼吸作用產(chǎn)生了“濃縮效應(yīng)”，對發(fā)酵培養(yǎng)物真蛋白含量的提高起到了重要作用。在144～240 h期間，真蛋白產(chǎn)率系數(shù)不斷下降，特別是204 h以后，真蛋白產(chǎn)率系數(shù)在數(shù)值上已經(jīng)低于發(fā)酵原料三七渣自身的真蛋白含量(0.099 7 g真蛋白/g干三七渣)。產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因在于:在總氮平衡的發(fā)酵體系中，分解作用會減少系統(tǒng)中蛋白質(zhì)總量［19］，需要通過對發(fā)酵周期的選擇來控制這種負(fù)效應(yīng)。

圖1 真蛋白含量和產(chǎn)率系數(shù)的動態(tài)變化

2.1.2 發(fā)酵培養(yǎng)物酶活的動態(tài)變化

發(fā)酵培養(yǎng)物FPA酶活和淀粉酶活的動態(tài)變化如圖2所示。

圖2 酶活的動態(tài)變化

由圖2可以看出，F(xiàn)PA酶活與淀粉酶活都先隨著發(fā)酵時間的延長逐漸增大，在發(fā)酵156 h后達(dá)到峰值，然后FPA酶活逐漸下降，淀粉酶活穩(wěn)定了24 h后也開始下降。酶活力的大小反映了體系中酶蛋白濃度的高低和對相應(yīng)底物的催化水解能力。本研究中酶活達(dá)到峰值的時間與發(fā)酵培養(yǎng)物中真蛋白含量以及生物量達(dá)到峰值的時間基本一致。在采用生木薯渣培育根霉時，發(fā)酵初期，α－淀粉酶活與葡萄糖淀粉酶活也都呈現(xiàn)不斷上升的趨勢［20］。采用黑曲霉發(fā)酵小麥麩皮、米糠、落花生草料以及鋸木屑時，CMC酶活在發(fā)酵24 h后達(dá)到最高，隨后逐漸下降;而FPA酶活卻在第3天才達(dá)到峰值，然后逐漸下降［16］。

2.1.3 干重的動態(tài)變化

發(fā)酵培養(yǎng)物干重的動態(tài)變化如圖3所示。

圖3 發(fā)酵培養(yǎng)物干重的動態(tài)變化

由圖3可以看出，發(fā)酵培養(yǎng)物干重隨著發(fā)酵時間的延長而逐漸降低，到發(fā)酵末期基本保持穩(wěn)定。在發(fā)酵24～72 h期間，發(fā)酵培養(yǎng)物干重的降速最大，72～168 h期間降速有所減緩，168～240 h期間基本維持不變。在這3個階段，發(fā)酵培養(yǎng)物干重的變化速率分別為 1.41、0.525、2.36 ×10－3g/d，發(fā)酵結(jié)束時產(chǎn)品收率為50.5%。而在采用黑曲霉發(fā)酵蔬菜廢棄物9 d后，發(fā)酵培養(yǎng)物僅減重4%［21］。發(fā)酵培養(yǎng)物減重的速率和比例與基質(zhì)中碳源是否容易被利用直接相關(guān)。

2.1.4 OD260的動態(tài)變化

參照文獻(xiàn)［11］所描述的方法提取發(fā)酵培養(yǎng)物中的核酸，將提取液稀釋5倍后測量其吸光度，間接表示發(fā)酵過程中菌體生長情況，結(jié)果如圖4所示。

由圖4可以看出，在0～132 h期間，OD260值逐漸增長;132～168 h期間，OD260值基本保持穩(wěn)定;168 h后OD260值有所下降。這與微生物生長曲線的變化趨勢基本一致。在采用黑曲霉固態(tài)發(fā)酵長豆角莢［22］和小麥麩皮［23］，采用產(chǎn)朊假絲酵母發(fā)酵蘋果渣［24］和米糠［25］的研究中發(fā)現(xiàn)菌體生長的動態(tài)變化趨勢也與此相似。

圖4 OD260的動態(tài)變化

2.1.5 水含量和水活度的動態(tài)變化

發(fā)酵過程中水含量和水活度隨時間的變化如圖5所示。

圖5 水含量和水活度的動態(tài)變化

由圖5可以看出，在發(fā)酵12～84 h期間，水活度輕微下降，可能是由于在此期間微生物新陳代謝非常活躍，在短期內(nèi)產(chǎn)生了大量的代謝熱，促進(jìn)了水分的蒸發(fā)，使得體系的含鹽量相對增加所造成。由圖5還可以看出，在發(fā)酵過程中發(fā)酵培養(yǎng)物的水含量逐漸增加，這與采用黑曲霉發(fā)酵炒制過的木薯渣［26－28］和蔬菜廢棄物［29］時發(fā)酵培養(yǎng)物水含量的動態(tài)變化趨勢相似。但是，在黑曲霉固態(tài)發(fā)酵小麥麩皮［23］過程中卻發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)物水含量沒有顯著變化。固態(tài)發(fā)酵過程中發(fā)酵培養(yǎng)物水含量的變化應(yīng)歸因于菌體生長、孢子形成和萌發(fā)、產(chǎn)物形成、蒸發(fā)作用對水的消耗和生成作用［29］。由于影響因素復(fù)雜，所以在不同發(fā)酵體系中往往呈現(xiàn)出不同的結(jié)果。

2.2 菌體生長動力學(xué)模型

發(fā)酵培養(yǎng)物的干物質(zhì)減重率隨時間的動態(tài)變化如圖6所示。采用Origin8.0軟件按照式(2)所示的對數(shù)模型對圖6中的數(shù)據(jù)進(jìn)行非線性擬合，擬合曲線和相關(guān)統(tǒng)計參數(shù)分別見圖6和表1。

圖6 菌體生長擬合曲線

表1 菌體生長動力學(xué)模型參數(shù)表

由圖6和表1可以看出，擬合曲線的相關(guān)性很好，符合統(tǒng)計檢驗的要求。根據(jù)上述結(jié)果，可以得到黑曲霉/產(chǎn)朊假絲酵母固態(tài)發(fā)酵三七渣生產(chǎn)蛋白飼料過程中的菌體生長動力學(xué)方程如下:

或

利用Origin8.0軟件對圖4中的擬合曲線進(jìn)行數(shù)值微分，可以獲得菌體生長速率隨時間變化的曲線，結(jié)果如圖7所示。

圖7 菌體生長速率的動態(tài)變化

由圖7可知，在發(fā)酵66 h后菌體生長速率達(dá)到最大值。

3 結(jié)論

3.1 發(fā)酵培養(yǎng)物真蛋白含量、酶活、核酸提取液OD260的變化趨勢基本一致:它們先隨發(fā)酵時間的延長而逐漸增大，然后又逐漸降低并趨于穩(wěn)定;發(fā)酵培養(yǎng)物水含量變化較大，而水活度變化較小。

3.2 以干物質(zhì)減重率作為表達(dá)菌體濃度的間接參數(shù)，菌體生長動力學(xué)適合采用對數(shù)模型進(jìn)行描述，最大干物質(zhì)減重率為52.22%，比生長速率常數(shù)μ=0.041 31 h－1。菌體生長速率在發(fā)酵66 h后達(dá)到最大值。

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