四氯乙烯脅迫對草魚抗氧化酶活性的影響及其機理

王桂燕,李 鋒,史濟(jì)月,周啟星 (.沈陽藥科大學(xué)制藥工程學(xué)院,遼寧 沈陽 006；.沈陽大學(xué)師范學(xué)院,遼寧 沈陽 0044；3.南開大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院,環(huán)境污染過程與基準(zhǔn)教育部重點實驗室,天津 30007)

四氯乙烯(PCE)廣泛用作干洗劑和金屬脫脂劑.PCE的大規(guī)模使用,以及對其不能充分回收,致使部分PCE在使用過程中釋放出來,排放到空氣、水或土壤中去,成為工廠車間、地表水和地下水中常見的污染物.國際腫瘤研究中心(IARC)將其列入人類可能致癌物(B2級)[1].外界污染物脅迫情況下,生物體體內(nèi)會產(chǎn)生大量的過剩自由基,引起對生物體的氧化脅迫,導(dǎo)致細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化,生物體生理代謝功能紊亂.超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化物酶(POD)是生物體體內(nèi)抗氧化防御系統(tǒng)的重要保護(hù)酶,它們能在一定基礎(chǔ)上清除活性氧自由基,維持膜系統(tǒng)的穩(wěn)定,降低氧化脅迫對細(xì)胞的傷害程度.抗氧化防御系統(tǒng)成分的改變可以作為機體受到氧化脅迫的早期預(yù)警生物標(biāo)志物[2-3],其含量水平、活性大小可作為測定生物對外界氧化脅迫反應(yīng)的生理生化指標(biāo),測定在氧化脅迫下草魚組織內(nèi)SOD和POD的活性,可以從一個側(cè)面揭示污染物對生物的毒性機制,間接反映環(huán)境中有毒有害物質(zhì)的存在.為此,以草魚(Ctenopharyngodon idellus)為試驗對象,研究 PCE對草魚的肝胰臟、腎臟和鰓組織的 SOD和POD的影響,探討以SOD和POD活性變化作為PCE污染生物指標(biāo)的可能性,為抗氧化防御系統(tǒng)的毒理學(xué)研究提供更多的基礎(chǔ)資料.并為水環(huán)境中該化合物污染影響的早期預(yù)報和防治提供實驗依據(jù).

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試動物 草魚購自沈陽北市場.選擇標(biāo)準(zhǔn):頭小體闊,鱗片完整舒展,行動活潑、反應(yīng)靈敏、逆水性強,外觀正常,個體均勻的健康魚,體長＜5cm,最大與最小體長之比＜1.5,體重為 (4.10±0.74)g.運回實驗室放入大型水族缸中,馴養(yǎng)7d(期間死亡率低于 5%)后進(jìn)行實驗.實驗用水為充分曝氣的自來水.

1.1.2 供試化合物 PCE,購自天津基準(zhǔn)化學(xué)試劑有限公司,氯化硝基四氮唑藍(lán)(NBT),L-蛋氨酸,核黃素,磷酸氫鈉,磷酸二氫鈉,EDTA,無水乙醇等為市售,均為分析純.

1.1.3 主要儀器 高速低溫冷凍離心機(HITACHI CP 80MX),紫外/可見分光光度計(WFZ 800–D3B),恒溫光照培養(yǎng)箱(MGC-350BP-2),溶解氧測定儀(HI9143).

1.2 實驗步驟與方法

采用靜態(tài)試驗法[4-5].試驗中用水為充分曝氣之后的自來水,水溫(17±1),pH℃值為6.5～6.8,溶解氧(DO)含量為 5.0mg/以上,硬度在210.1mg/L(以 CaCO3計)左右.試驗在 25cm×18cm×25cm的小水族缸中進(jìn)行.定期監(jiān)測溶液的溫度、pH值、DO.水族缸全天曝氣.為防止餌料的影響,試驗期間不喂食.

將一定量的四氯乙烯用無水乙醇(乙醇的體積分?jǐn)?shù)不超過10%)溶解,然后用事先充分曝氣的自來水稀釋到所需實驗濃度.

1.2.1 試驗濃度設(shè)計 在單一急性毒性試驗基礎(chǔ)上,求得PCE污染物96h的LC50值為34.56mg/L[6],然后分別選取 1/2LC50、1/4LC50、1/8LC50和1/16LC504個濃度組,每個濃度設(shè)3個平行組,同時設(shè)1個空白對照組,每1濃度組隨機放魚10尾.

1.2.2 酶活性測定 PCE暴露試驗每隔24h更換1次新鮮試驗液.分別在暴露的第24、48、72、96、120、144和168h從每濃度組中和對照組中隨機取出3條草魚,迅速解剖,取肝胰臟、腎臟和鰓等組織,然后于 50mmol/L預(yù)冷磷酸鹽緩沖溶液(pH7.8,含0.1mmol/L的EDTA)中勻漿,將勻漿液轉(zhuǎn)移到10mL離心試管中于4℃、15000r/min條件下低溫離心 30min,上清液即為酶提取液,將其低溫保存.SOD活性的測定采用氯化硝基四氮唑藍(lán)(NBT)光化還原法[7],1個酶活性單位(U)定義為引起3.0mL反應(yīng)液達(dá)到50%抑制所需的酶量,酶活性以U/g·FW表示.POD的活性測定采用愈創(chuàng)木酚(鄰甲氧基苯酚)法[7],定義在波長470nm處吸光度值變化0.01代表1個酶活力單位(U),酶活性以 U/(g·FW·min)表示,組織質(zhì)量均以鮮質(zhì)量計.

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,數(shù)據(jù)用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)偏差(Mean±SD)表示.并用t檢驗法對組間數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析,P＜0.05表示差異顯著,P＜0.01表示差異極顯著.

2 結(jié)果與分析

2.1 PCE對草魚SOD活性的影響

2.1.1 PCE對草魚肝胰臟SOD活性的影響 從表1可以看出,在PCE污染條件下,隨著暴露濃度增加,24和48h內(nèi)草魚肝胰臟SOD活性變化顯著(P＜0.05).與0mg/L相比,草魚肝胰臟SOD活性在最低濃度組(2.17mg/L)時,受到顯著誘導(dǎo)(P＜0.05),在其他濃度組時其活性又被顯著抑制(P＜0.05);暴露 72h,最高濃度組(17.28mg/L)的草魚肝胰臟SOD 活性仍然被顯著抑制(P＜0.05),其他較低濃度組的草魚肝胰臟 SOD活性均被顯著誘導(dǎo)(P＜0.05);暴露 96h,所有濃度組的草魚肝胰臟SOD 活性均被顯著誘導(dǎo)(P＜0.05);當(dāng)暴露時間繼續(xù)增加到 120h以上時,所有濃度組草魚肝胰臟SOD 活性被抑制,其活性顯著低于對照(P＜0.05).方差分析表明,暴露濃度對草魚肝胰臟SOD活性影響極顯著(P＜0.01),暴露時間對草魚肝胰臟SOD活性影響顯著(P＜0.05),并且PCE濃度與暴露時間存在顯著的交互作用(P＜0.01).

表1 PCE對草魚肝胰臟SOD活性的影響(U/g·FW)Table 1 Effects of PCE on the SOD activity (U/g·FW) in the grass carp liver tissues

2.1.2 PCE對草魚腎臟SOD活性的影響 從表2可以看出,在PCE污染條件下,隨著暴露濃度的增加,24h內(nèi)草魚腎臟 SOD活性變化顯著降低(P＜0.05);48h時草魚腎臟在2.17和4.34mg/L時,受到顯著抑制(P＜0.05),而在 8.69和 17.28mg/L時其活性又被誘導(dǎo),均顯著高于對照(P＜0.05);在暴露 72h時,低濃度組(2.17mg/L)草魚腎臟被顯著誘導(dǎo)(P＜0.05),而在 4.34mg/L以上濃度組腎臟的 SOD活性被極顯著抑制(P＜0.01);在暴露 96h以上時,各個濃度組的草魚腎臟SOD活性均被顯著抑制(P＜0.05).方差分析表明,暴露濃度和暴露時間對草魚腎臟 SOD活性影響顯著(P＜0.05),并且 PCE濃度與暴露時間存在顯著的交互作用(P＜0.01).

表2 PCE對草魚腎臟SOD活性的影響(U/g·FW)Table 2 Effects of PCE on the SOD activity (U/g·FW) in the grass carp kidney tissues

2.1.3 PCE對草魚鰓組織 SOD活性的影響 從表3可以看出,在PCE污染條件下,隨著暴露濃度的增加,24h內(nèi)當(dāng)濃度為 2.17mg/L時,草魚鰓組織SOD 活性變化顯著降低(P＜0.05),而當(dāng)濃度增加到4.29mg/L鰓組織的SOD活性又恢復(fù)到與對照組沒有顯著差異(P＞0.05),當(dāng)濃度繼續(xù)增加時,鰓組織的SOD活性又呈現(xiàn)顯著被抑制(P＜0.05);暴露48h以上時草魚鰓組織在污染暴露的濃度組中均呈現(xiàn)顯著被抑制(P＜0.05).方差分析表明,暴露濃度和暴露 時間對草魚鰓組織SOD活性影響不顯著(P＞0.05).

表3 PCE對草魚鰓組織SOD活性的影響(U/g·FW)Table 3 Effects of PCE on the SOD activity (U/g·FW) in the grass carp gill tissues

2.2 PCE對草魚POD活性的影響

2.2.1 PCE對草魚肝胰臟POD活性的影響 從表4可以看出,在PCE污染條件下,隨著暴露濃度的增加,24h內(nèi)草魚肝胰臟 POD活性變化顯著(P＜0.05).與0mg/L相比,草魚肝胰臟POD活性在暴露的濃度范圍內(nèi)均受到顯著抑制(P＜0.05);在暴露48h時,在2.17、4.34和8.69mg/L濃度組活性顯著低于對照(P＜0.05),而在最高濃度組(17.28mg/L),其 POD 值又被誘導(dǎo),顯著高于對照(P＜0.05);暴露72h時,在4.34mg/L濃度組肝胰臟POD 活性被誘導(dǎo),其值顯著高于對照(P＜0.05);在暴露96h以上,草魚肝胰臟的POD活性顯著被抑制(P＜0.05).方差分析表明,暴露時間對草魚肝胰臟POD活性影響極顯著(P＜0.01),并且PCE濃度與暴露時間存在顯著的交互作用(P＜0.01).

2.2.2 PCE對草魚腎臟POD活性的影響 從表5可以看出,在PCE污染條件下,隨著暴露濃度的增加,24h內(nèi)草魚腎臟 POD活性變化顯著(P＜0.05),低濃度組(2.17mg/L)草魚腎臟 POD 顯著高于對照組(P＜0.05),而高濃度組的POD值都顯著低于對照組(P＜0.05);48h時草魚腎臟在較低濃度(2.17和4.34mg/L)組,受到顯著抑制(P＜0.05),而在較高濃度(8.69和17.28mg/L)時其活性又被誘導(dǎo),均顯著高于對照(P＜0.05);在暴露 72h時,低濃度組(2.17mg/L)草魚腎臟 POD活性被顯著誘導(dǎo)(P＜0.05);在暴露120h以上時,各個濃度組的草魚腎臟POD活性均被顯著抑制(P＜0.05).方差分析表明,PCE暴露時間對草魚腎臟POD活性影響極顯著(P＜0.01),并且 PCE濃度與暴露時間存在顯著的交互作用(P＜0.01).

表4 PCE對草魚肝胰臟POD活性的影響[U/(g·FW·min)]Table 4 Effects of PCE on the POD activity [U/(g·FW·min)]in the grass carp liver tissues

2.2.3 PCE對草魚鰓組織 POD活性的影響 從 表6可看出,隨著PCE暴露濃度的增加,24h內(nèi)各暴露的濃度內(nèi)草魚鰓組織 POD活性變化顯著增加(P＜0.05);隨著染毒時間的延長,較低濃度組鰓組織的POD活性被誘導(dǎo),顯著高于對照(P＜0.05),而當(dāng)濃度增加到17.28mg/L時,鰓組織的POD活性又恢復(fù)到與對照無顯著差異(P＞0.05);當(dāng)染毒時間延長到144h以上時,各暴露的濃度組內(nèi)鰓組織的POD活性又呈現(xiàn)顯著被抑制(P＜0.05).方差分析表明,暴露時間對草魚鰓組織POD活性影響顯著(P＜0.05).

表5 PCE對草魚腎臟POD活性的影響[U/(g·FW·min)]Table 5 Effects of PCE on the POD activity [U/(g·FW·min)]in the grass carp kidney tissues

表6 PCE對草魚鰓組織POD活性的影響[U/(g·FW·min)]Table 6 Effects of PCE on the POD activity [U/(g·FW·min)]in the grass carp gill tissues

3 討論

當(dāng)有機體受到污染脅迫時,其體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)酶活性改變,發(fā)生氧化應(yīng)激作用,這種氧化應(yīng)激作用因有機體及污染物種類、脅迫濃度和暴露時間不同而不同[8-11].氧化應(yīng)激反應(yīng)是生物體的活性氧簇(ROS)和抗氧化防御系統(tǒng)之間不平衡的結(jié)果

[12],ROS是過渡金屬離子、農(nóng)藥、石油污染物等物質(zhì)誘導(dǎo)產(chǎn)生的[13].ROS 的逐步產(chǎn)生可以導(dǎo)致蛋白質(zhì)和脂質(zhì)的氧化,基因表達(dá)的改變以及細(xì)胞氧化還原狀態(tài)的變化[14].抗氧化防御系統(tǒng)作為活性氧的去除系統(tǒng), 在參與活性氧的清除以及機體的保護(hù)性防御反應(yīng)中發(fā)揮巨大作用, 主要包括酶系統(tǒng)(SOD、POD 等)與一些小分子抗氧化物.生物體的抗氧化防御系統(tǒng)對污染物脅迫相當(dāng)敏感,特別是SOD對多種污染物的反應(yīng)均很敏感.SOD被認(rèn)為是抵抗過氧化反應(yīng)的保護(hù)酶之一[15],是生物體內(nèi)唯一以超氧陰離子作為專一性底物的抗氧化酶.在PCE脅迫下,低濃度(2.17mg/L)的PCE脅迫較短時間(96h)內(nèi)導(dǎo)致草魚肝胰臟組織的 SOD活性首先升高,說明此時草魚肝胰臟和腎臟體內(nèi)積累了大量的活性氧自由基,SOD為清除這些干擾物質(zhì)而被誘導(dǎo).已有研究表明,生物受到輕度逆境脅迫時,SOD活性往往升高[16].如水絲蚓在Hg2+的應(yīng)激條件下,當(dāng) Hg2+濃度在 8.000～9.241μL/L范圍時,SOD活性顯著上升[17];暴露于 0.5mg/L BaP中7d時,大彈涂魚肝臟中SOD活性被顯著誘導(dǎo)[18];草魚在低濃度(0.01mg/L和 0.20mg/L)十二烷基硫酸鈉暴露時,肌肉、血漿及肝臟SOD均受到不同程度的誘導(dǎo)[19],這些與本試驗中得到的結(jié)果基本一致.另外,在 PCE脅迫下,低濃度(2.17mg/L)的PCE脅迫較短時間(96h)內(nèi)也導(dǎo)致草魚腎臟組織和鰓組織的POD活性也升高. POD是生物體內(nèi)重要的抗氧化防御系統(tǒng),可催化過氧化氫與氫供給體之間的氧化反應(yīng),從而分解有毒物質(zhì)H2O2.當(dāng)生物體受到輕度逆境脅迫時,POD活性往往升高,以清除體內(nèi)的活性氧自由基.然而抗氧化酶清除自由基的能力畢竟有限,在長期的氧化脅迫下,氧化損傷難以避免,進(jìn)而造成機體細(xì)胞病變導(dǎo)致疾病發(fā)生.一些研究也表明,抗氧化酶活性的變化與污染物的濃度具有相關(guān)性[20],在其耐性限度內(nèi),隨著污染物濃度的增加,POD和SOD活性也增加;但超過了其耐性閾值,細(xì)胞受到嚴(yán)重傷害,導(dǎo)致其應(yīng)激的能力下降,因此POD和SOD活性也就不可避免地降低,因此一般情況下,嚴(yán)重脅迫能夠?qū)е翽OD、SOD酶活下降[21-23].本研究中,發(fā)現(xiàn)過度脅迫時也能夠?qū)е卖~體內(nèi)的SOD和POD酶活性受到顯著的抑制.這一方面可能是由于草魚出現(xiàn)中毒癥狀,致使SOD代謝外源性化合物的能力受到破壞或飽和[24],另一方面可能是由于草魚體內(nèi)抗氧化防御系統(tǒng)的其他成分的介入,清除了部分活性氧[25].另外可能是當(dāng)重度或長時間逆境脅迫超出生物體抗氧化防御系統(tǒng)的防御能力時,致使POD活性降低,使生物體內(nèi)積累過量的活性氧,從而傷害生物體.PCE通過與酶發(fā)生相互作用而改變其蛋白結(jié)構(gòu),從而改變其功能活性[26].在試驗48h和76h時草魚腎臟POD活性變化出現(xiàn)波動,其原因有待于進(jìn)一步試驗研究.草魚鰓組織只有在中等濃度組(4.34mg/L)在24h內(nèi)SOD酶活性與對照組沒有顯著變化(P＞0.05),其它濃度組在整個暴露時間內(nèi) SOD酶均受到顯著抑制(P＜0.05).鰓組織的POD酶活性在24h內(nèi)均顯著升高,隨后就降低.草魚肝胰臟、腎臟和鰓組織中SOD活性和敏感性的不同,可能與它們的不同生理功能有關(guān).肝臟是體內(nèi)主要的解毒器官,肝巨噬細(xì)胞有活躍的吞噬能力,毒物在肝臟內(nèi)氧化、還原或水解過程中會產(chǎn)生大量的O2-,從而使肝組織SOD活性較高.另外,草魚在PCE暴露時,PCE由鰓進(jìn)入血液作用到很多靶組織細(xì)胞,這些被傷害的組織細(xì)胞產(chǎn)生的代謝紊亂產(chǎn)物又匯集到肝臟,從而引起肝組織SOD活性的變化.腎臟是機體排泄污染物及其代謝產(chǎn)物的重要臟器,由于在腎內(nèi)毒物代謝產(chǎn)物得到濃縮,因而對腎組織引起損害產(chǎn)生腎毒性.而鰓只是呼吸器官,既不具備解毒功能又沒有排泄功能,因此鰓組織的SOD活性要比肝和腎的低得多.筆者認(rèn)為,由于魚首先通過鰓呼吸,污染物最先接觸鰓組織,所以鰓組織的酶活性降低.

在試驗中筆者觀察到,當(dāng)草魚受PCE脅迫短時間內(nèi)肝胰臟和腎臟組織中SOD和POD酶活性首先受到抑制,隨著暴露時間的延長,草魚肝胰臟和腎臟組織的SOD和POD活性又顯著升高(如草魚暴露在4.34mg/L和8.69mg/L濃度組中,其肝胰臟組織SOD酶活性在48h內(nèi)首先被顯著抑制,污染暴露 72h其酶活性又被顯著誘導(dǎo)).這種現(xiàn)象與Beaumont等[27]的研究結(jié)果類似.Stebbing[28]認(rèn)為毒物在低濃度下出現(xiàn)的這種現(xiàn)象,是其在無毒情況下的刺激反應(yīng),他把這一現(xiàn)象稱為“毒物興奮效應(yīng)”.迄今為止,研究證明,“毒物興奮效應(yīng)”具有普遍性[29].SOD、POD酶活性升高一方面說明草魚受到了一定的刺激; 另一方面也說明草魚對外界刺激的反應(yīng)能力很強,通過提高酶活性來保護(hù)機體免受更深的損傷.隨著 PCE脅迫暴露的時間繼續(xù)延長,草魚肝胰臟和腎臟SOD和POD酶活性再次顯著降低,最后出現(xiàn)草魚個體死亡.可見SOD和POD酶活性的降低所造成的活性氧傷害是引起草魚死亡的重要原因之一.

4 結(jié)論

4.1 草魚肝胰臟和腎臟組織的SOD、POD酶活比鰓組織的高.

4.2 PCE脅迫導(dǎo)致草魚肝胰臟和腎臟組織的SOD和POD活性均有顯著變化. SOD、POD酶活能夠反映出污染物對草魚的毒性作用.

4.3 較低濃度的脅迫能夠誘導(dǎo)草魚肝胰臟和腎臟組織的SOD、POD酶活,但是過度脅迫將導(dǎo)致草魚肝胰臟和腎臟組織的SOD、POD酶活的下降,進(jìn)而產(chǎn)生毒性效應(yīng). SOD和POD酶活性的降低所造成的活性氧傷害是引起草魚死亡的重要原因之一.

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