藻類與高等植物中植物螯合肽PCs的研究進(jìn)展

張瑜　侯和勝

摘 要：植物螯合肽（PCs）是重金屬螯合肽，對(duì)高等植物、真菌、微藻中有毒重金屬的解毒起著重要作用。介紹了PCs生物合成和功能的最新研究進(jìn)展。

關(guān)鍵詞：植物螯合肽；植物螯合肽合酶；重金屬結(jié)合肽；高等植物；藻類

中圖分類號(hào)：Q946.5 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A DOI編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2014.04.004

1985年，研究人員將從經(jīng)鎘處理后的高等植物懸浮細(xì)胞中分離出來的重金屬結(jié)合肽稱作植物螯合肽（PCs），。此后，PCs不斷從一些真核生物中找到，包括高等植物、真菌和微藻。PCs不但可經(jīng)Cd誘導(dǎo)合成，也可通過一些其他有毒的、重要的重金屬誘導(dǎo)合成，如Hg、Cu、Zn等。許多生理學(xué)研究指出，PCs的作用包括重金屬脫毒和重要金屬離子細(xì)胞內(nèi)水平平衡的保持。1999年，PCs合成酶基因在高等植物和裂殖酵母中的存在被確定和描述。此后，PCs基因和PCs合成酶相似基因已確定存在于蠕蟲和原核生物器官中。這些發(fā)現(xiàn)指出PCs在蠕蟲以及一些與真核生物光合有機(jī)體相似的原核生物和菌類中對(duì)重金屬脫毒起著重要的作用。

1 PCs的結(jié)構(gòu)和功能

PCs的主要結(jié)構(gòu)通常含有（γ-Glu-Cys）n-Gly形式。PCs通過重金屬如Cd，Cu，Zn，Hg，Ag和As形成復(fù)合物。幾個(gè)不同鏈長(zhǎng)度的PCs分子接連著合成并立即與重金屬形成復(fù)合物。例如在一個(gè)PCs-Cd復(fù)合物的結(jié)構(gòu)模型中，Cd協(xié)調(diào)地從單個(gè)或復(fù)合的PCs分子中結(jié)合1個(gè)，2個(gè)，3個(gè)或最大容量4個(gè)S原子，最終導(dǎo)致形成無定形的復(fù)合物[1]。PCs鏈越長(zhǎng)，每個(gè)分子具有更強(qiáng)的pH穩(wěn)定性和金屬結(jié)合能力[2]。

重金屬的毒性是因?yàn)樯镏苯咏Y(jié)合金屬離子而導(dǎo)致的功能性蛋白的失活，或者因?yàn)榛钚匝趸铮≧OS）加速增加導(dǎo)致的活性氧損傷[3-4]。在高等植物中， PCs的誘導(dǎo)合成是經(jīng)重金屬脅迫后與金屬形成復(fù)合物以此來脫毒[5]。一個(gè)抗氧化活性分析顯示，PCs分子在體外對(duì)ROS如H2O2和O2-有很強(qiáng)的去污活性。而且，對(duì)這些ROS耐受性的增強(qiáng)已經(jīng)在綠藻杜氏鹽藻（ATCC30929）中獲得實(shí)現(xiàn)，通過用Zn對(duì)杜氏鹽藻進(jìn)行預(yù)處理導(dǎo)致PCs合成[6]。這些研究揭示了PCs不但對(duì)重金屬的螯合，而且對(duì)由重金屬引起的氧化脅迫的緩解都起著重要作用。

2 PCs的生物合成途徑及其調(diào)控

PCs的生物合成由植物螯合肽合成酶（PCs合成酶）催化，這種酶需要重金屬作為活化因子。Cd是這種酶最有效的催化劑，而其他重金屬對(duì)它的催化程度都要比Cd小。

1999年，3個(gè)試驗(yàn)組分別證明了編碼PCs合成酶的基因，即擬南芥AtPCS1基因、裂殖酵母SpPCS基因和小麥TaPCS基因。預(yù)測(cè)的由AtPCS1，TaPCS1和SpPCS編碼的氨基酸序列分析顯示，N端區(qū)域高度保守，而C端區(qū)域則不定。

在高等植物中， PCs合成酶通常是組成酶，即使暴露于重金屬下，它的基因也不會(huì)被誘導(dǎo)。通過對(duì)擬南芥AtPCS1基因的Northern和RT-PCR分析已證明這點(diǎn)，研究還發(fā)現(xiàn)即使暴露于像Cd、Zn或Cu這樣的重金屬，或者氧化脅迫、鹽脅迫、茉莉酸或水楊酸處理[7-8]，也沒有AtPCS1轉(zhuǎn)錄調(diào)控。然而在植物發(fā)育的早期階段，發(fā)現(xiàn)用Cd處理的擬南芥AtPCS1 mRNA水平比沒用Cd處理的要高2倍。由此看來，在特異器官和發(fā)育階段對(duì)有毒重金屬需要很強(qiáng)的防御，PCs合成酶基因的表達(dá)可能被調(diào)控。

除了重金屬能激活PCs合成酶，PCs合成酶也可被細(xì)胞內(nèi)的GSH水平調(diào)控。眾所周知，GSH的合成受氧化脅迫調(diào)控。高等植物中外源性應(yīng)用或內(nèi)源性產(chǎn)生的H2O2能增加GSH水平[9]。Xiang和Oliver指出[10]，經(jīng)暴露于Cd后，PCs合成受到多樣水平調(diào)控（多層次）。在他們提出的模型中，Cd通過激活PCs合成酶從GSH中誘導(dǎo)PCs的合成，并且提出GSH的合成不但通過GSH生物合成途徑的轉(zhuǎn)錄激活，也需要靠ROS的內(nèi)源性產(chǎn)物如H2O2的刺激。在杜氏鹽藻中可能存在相似的重金屬誘導(dǎo)PCs合成的調(diào)控機(jī)制。在這類綠藻中，經(jīng)Zn處理的細(xì)胞中PCs合成水平明顯要高于那些經(jīng)Cd處理的細(xì)胞[11]。杜氏鹽藻這個(gè)獨(dú)特的特征是由于經(jīng)Zn處理后導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)H2O2水平增加從而促使GSH有很大的通量，而且與高等植物相比，Zn更加能活化PCs合成酶。

3 原核藻類PCs合成酶基因的確定與描述

通過使用NCBI-BLAST tool（http：//www.ncbi.nim .nih.gov/blast/）來確定一些原核藻類中編碼PCs合成酶相似蛋白的基因，這些原核藻類包括藍(lán)藻發(fā)菜（一種淡水藻類）PCC7120（DDBJ/GenBank/EMBL accession no.AF384110），原綠球藻MIT9313（BX572098），多變魚腥藻ATCC29413（NCBI accession no.ZP_00162897），點(diǎn)狀念珠藻（ZP_00107402）和紅海束毛藻 IMS 101（ZP_00324863）。編碼預(yù)測(cè)蛋白的這些基因有共同特點(diǎn)：同真核生物一樣，PCs合成酶N端區(qū)域高度同源，但是比真核生物PCs合成酶序列保守N端少了4個(gè)半胱氨酸殘基（真核生物PCs合成酶保守的N端區(qū)域有5個(gè)半胱氨酸）。盡管發(fā)菜PCC7120中編碼蛋白（NsPCs）的alr0975基因與真核生物PCs合成酶基因很相似，但是，即使在用Cd處理的細(xì)胞內(nèi)也沒有PCs的積累，也沒觀察到alr0975基因表達(dá)。然而，在大腸桿菌里表達(dá)的重組NsPCs，在體內(nèi)外都能催化PCs合成。根據(jù)這些結(jié)果，NsPCs似乎是在真核生物中發(fā)現(xiàn)的PCs合成酶的最原始形式。

4 重金屬脫毒系統(tǒng)的獲得和功能性進(jìn)化

在光合生物中，高等生物的葉綠體被認(rèn)為起源于藍(lán)藻和異養(yǎng)真核生物細(xì)胞之間的共生體。在高等植物中全長(zhǎng)的PCs合成酶可能是從藍(lán)藻中進(jìn)化來的。相反，在真核藻類中，一個(gè)PCs合成酶基因也沒被確定，盡管已經(jīng)在一些品系中證實(shí)，在某種程度上有與高等植物相似的PCs被誘導(dǎo)合成。正如上面所說，在杜氏鹽藻中，PCs合成不是被Cd而是被Zn誘導(dǎo)的[10]。而且，優(yōu)越的PCs亞類不是PC2或PC3，而是PC4。

對(duì)高等植物和藍(lán)藻中的PCs合成酶同源基因序列分析顯示，包括NsPCs藍(lán)藻合成酶都展現(xiàn)PCs合成酶N端保守區(qū)域的高度同源，盡管NsPCs缺少C端易變區(qū)域，而且在高等植物PCs合成酶的N端區(qū)域有5個(gè)半胱氨酸殘基。而且，重組的NsPCs可在大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)和體外起到PCs合成酶的作用。根據(jù)這些結(jié)果，藍(lán)藻PCs合成中這些PCs的合成特征與高等植物中的那些不同，杜氏鹽藻的PCs合成酶同樣有與高等植物酶不同的結(jié)構(gòu)和功能。如果PCs合成酶基因在真核微藻如杜氏鹽藻中被確定，那么PCs合成酶功能的進(jìn)一步研究和它們的變化，就可能為這個(gè)酶通過真核藻類的方式，從藍(lán)藻到高等植物的分子進(jìn)化過程的說明提供重要信息。例如NsPCs被認(rèn)為代表植物PCs合成酶的進(jìn)化起源。然而，在藍(lán)藻發(fā)菜PCC 7120中，既沒有PCs的積累，也沒有編碼NsPCs的alr0975基因的表達(dá)。所以，NsPCs被建議是PCs合成酶原始的或祖先形式，而且它的基因表達(dá)的調(diào)控機(jī)制，與目前在高等植物中表達(dá)的已有全長(zhǎng)的PCs合成酶的調(diào)控機(jī)制不同。

5 總結(jié)與展望

PCs對(duì)植物的重金屬解毒有很重要的作用[12]。在高等植物中，PCs研究的比較清楚，PCs合成酶也已被確定，但在藻類中其研究還不完善，相信隨著生物技術(shù)的不斷進(jìn)步，這一領(lǐng)域必將取得巨大進(jìn)展。

參考文獻(xiàn)：

[1] Cruz B H， Diaz-Cruz J M， Sestakova I， et al. Differential pulse voltammetric study of the complexation of Cd（Ⅱ）by the phytochelatins （gamma-Glu-Cys）（2）Gly assisted by multivariate curve resolution[J].J Electroanal Chem， 2002，520：111-118.

[2] Mehra R K， Kodati R， Abdullah R. Chain lengthdependent Pb（Ⅱ）-coordination in phytochelatins[J].Biochem Biophys Res Commun， 1995，215：730-736.

[3] Stohs S J， Bagchi D. Oxidative mechanisms in the toxicity of metal ions[J].Free Rad Biol Med，1995，18：321-336.

[4] Schützendubel A， Polle A. Plant responses to abiotic stresses：heavy metal-induced oxidative stress and protection by mycorrhization[J].J Exp Bot，2002，53：1 351-1 365.

[5] 王海鷗，鐘廣蓉，劉曉峰，等.小麥在銅、鎘脅迫下體內(nèi)含巰基物質(zhì)對(duì)解毒機(jī)制的研究[J].華北農(nóng)學(xué)報(bào)，2008（3）：158-161.

[6] Tsuji N， Hirayanagi N， Okada M， et al. Enhancement of tolerance to heavy metals and oxidative stress in Dunaliella tertiolecta by Zn-induced phytochelatin synthesis[J]. Biochem Biophys Res Commun，2002，293：653-659.

[7] Vatamaniuk O K， Mari S， Lu Y P， et al. Mechanism of heavy metal ion activation of phytochelatin（PC）synthase[J]. J Biol Chem，2000，275：31 451-31 459.

[8] Cazale A C， Clemens S. Arabidopsis thaliana expresses a second functional phytochelatin synthase[J].FEBS Lett，2001，

507：215-219.

[9] May M J， Leaver C J. Oxidative stimulation of glutathione synthesis in Arabidopsis thaliana suspension cultures[J].Plant Physilo，1993，103：621-627.

[10] Xiang C， Oliver D J. Glutathione metabolic genes coordinately respond to heavy metals and jasmonic acid in Arabidopsis[J].Plant Cell，1998（10）：15 339-15 350.

[11] Hirata K， Tsujimoto Y， Namba T， et al. Strong induction of phytochelatin synthesis by zinc in marine green alga， Dunaliella tertiolecta[J].J Biosci Bioeng， 2001，92：24-29.

[12] 孫靜文，程明芳，梁國(guó)慶，等.莧菜AmPCS基因的克隆及表達(dá)載體構(gòu)建[J].華北農(nóng)學(xué)報(bào)，2012（2）：44-49.