毛細(xì)管電泳分離蛋白質(zhì)的研究進(jìn)展

宮紅梅

摘 要 綜述了無膠篩分毛細(xì)管電泳在和蛋白質(zhì)的分離分析中的應(yīng)用實(shí)例，對這種方法的前景展望及發(fā)展趨勢進(jìn)行

討論。

關(guān)鍵詞 高效毛細(xì)管電泳；無膠篩分；蛋白質(zhì)；電滲流

中圖分類號：O629.73 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1671-7597（2014）07-0160-01

近年來，蛋白質(zhì)組學(xué)的研究進(jìn)展迅速，其中研究熱點(diǎn)集中于蛋白質(zhì)的分離檢測與結(jié)構(gòu)鑒定上。目前有關(guān)蛋白質(zhì)的研究手段和方法較多，各有優(yōu)缺點(diǎn)。毛細(xì)管電泳技術(shù)具有高效、快速、樣品用量極少等特點(diǎn)，適合生物大分子的分析檢測。但毛細(xì)管電泳分離蛋白質(zhì)時，首先要解決的問題是蛋白質(zhì)樣品對管壁的吸附。

無膠篩分毛細(xì)管電泳是在緩沖溶液中添加線性高分子而不進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)，溶液中高分子之間相互交纏形成網(wǎng)孔，從而對蛋白質(zhì)等生物大分子按其大小進(jìn)行篩分分離，無膠篩分的機(jī)制還不明確，存在幾種理論模型：交纏溶液理論和高分子亞濃溶液線團(tuán)收縮理論，Ogston、爬行和偏爬行模型和碰撞模型[1]。高分子溶液加入到緩沖液中，使電滲流得到抑制，同時也抑制了蛋白質(zhì)的吸附，與凝膠電泳相比，它的制備工藝相對簡單，壽命較長，操作簡便，容易清洗等優(yōu)點(diǎn)。

傳統(tǒng)的SDS-凝膠電泳分離蛋白質(zhì)的分辨率低，操作繁瑣耗時，且所用藥品有毒性，毛細(xì)管凝膠電泳可以克服上述缺點(diǎn)，但制備工藝復(fù)雜，凝膠壽命短，填充過程中容易產(chǎn)生氣泡，影響分離。無膠篩分電泳具有更多的優(yōu)點(diǎn)，容易填充和沖出，高分子聚合物在管中形成動態(tài)篩分網(wǎng)絡(luò)，能很好的保持操作重現(xiàn)性，而且可以抑制電滲流，減少吸附。而且可以選擇篩分介質(zhì)的種類，濃度，分子量，以適合分離不同的蛋白質(zhì)混合物。

1 無膠篩分毛細(xì)管電泳的應(yīng)用

目前，無膠篩分體系已較多應(yīng)用于低聚核苷酸、DNA限制性片段、聚合酶鏈反應(yīng)產(chǎn)物的分離研究領(lǐng)域中。郭栩等人根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果得出結(jié)論，在無膠篩分體系中，盡管影響分離的主要因素在于篩分體系本身，但柱壁的處理對DNA片段的分離結(jié)果也不可忽視[3]。

李克，袁倚盛等在硼酸緩沖溶液中加適量的PEG8000作為改性劑，以非涂漬毛細(xì)管柱電泳分離人血清蛋白質(zhì)，血清樣品經(jīng)硼酸緩沖液（50 mmol/L，pH=8.80）稀釋后，以0.1 mol/L的硼酸緩沖液（pH9.35，PEG8000為4 g/L）為電泳介質(zhì)，在50 μm×37 cm彈性石英毛細(xì)管柱（Leff=32 cm）中進(jìn)行電泳分離，在紫外波長200 nm處檢測，12 min內(nèi)便可完成對血清中蛋白質(zhì)的電泳分離。方法簡便、快速、峰遷移重復(fù)性好，適用于臨床常規(guī)檢驗(yàn)和血中蛋白質(zhì)的研究。張振中，吳逸明等以線性高分子聚合物聚乙二醇（PEG20000）作為篩分介質(zhì)，150 mmol/L Tris -100 mmol/L CHES（pH8.7）作為運(yùn)行緩沖液，運(yùn)行電壓20 kV，磷酸化酶B、牛血清白蛋白、肌動蛋白、碳酸酐酶、煙草花葉病毒外殼蛋白和胰蛋白酶抑制劑達(dá)到基線分離。隨PEG相對分子質(zhì)量的不同PEG的性質(zhì)發(fā)生改變，相對分子質(zhì)量大小決定了其鏈的長短及篩孔徑的大小，也就決定了被分離的蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量范圍。因此選定合適的PEG，優(yōu)化實(shí)驗(yàn)參數(shù)是實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵工作。在實(shí)驗(yàn)中應(yīng)根據(jù)趙京山，溫進(jìn)坤等人建立了檢測微量蛋白質(zhì)方法，電泳緩沖液為含有30 g/L PEG 20000硼酸鹽緩沖液150 mmol/L，pH10.0，骨橋蛋白標(biāo)品的倍比稀釋，依次經(jīng)NGSCE方法檢測，確定所建方法的靈敏度及峰面積和OPN濃度之間的關(guān)系；利用回收實(shí)驗(yàn)，根據(jù)OPN的濃度和峰面積計(jì)算回收率。結(jié)果表明，該無膠篩分毛細(xì)管電泳的方法能滿足檢測微量蛋白質(zhì)的需要[3]。

Garcia-Ruiz等[4]分離牛乳清蛋白（α-乳清蛋白和β-乳球蛋白（A+B））和大豆蛋白時使用的是羥乙基甲基纖維素/尿素體系。Rumbo等[5]同樣用無膠篩分體系成功分析50多種結(jié)構(gòu)相似、理化性質(zhì)接近的麥膠蛋白。Bean等通過比較幾種不同的篩分介質(zhì)在SDS-CE中的分離效果，建立了簡捷，快速，重現(xiàn)性好的分離小麥蛋白的方法。Somerville等[6]用無膠篩分體系實(shí)現(xiàn)了臨床應(yīng)用的糖細(xì)胞集落刺激因子（G-CSF）的異構(gòu)體的

分離。

2 影響因素及控制

zeta電勢是影響電滲流的主要因素，緩沖液性質(zhì)、毛細(xì)管表面特性都與電勢大小密切相關(guān)。同時，zeta電勢與擴(kuò)散層厚度成正比，而擴(kuò)散層厚度又與電解質(zhì)濃度的平方根倒數(shù)成正比，所以，緩沖溶液的組成、酸堿度、毛細(xì)管內(nèi)壁表面的活化狀態(tài)以及環(huán)境溫度成為影響電滲流的間接因素，此外，當(dāng)其他條件一定時，電場強(qiáng)度也影響電滲流的大小?？刂品椒ㄓ懈淖兙彌_液的特性，對柱表面進(jìn)行處理，外加徑向電場。

分離酸性蛋白質(zhì)時，采用pH7-10的緩沖體系，可以減少蛋白質(zhì)對管壁的吸附。不同的緩沖離子類型會對電滲流以及蛋白質(zhì)樣品有不同的作用，硼酸-硼砂緩沖溶液和Tris-HCl緩沖溶液的分離能力優(yōu)于磷酸鹽緩沖液，能得到較好的峰形和較快的遷移時間；分離體系的pH值對分離度及柱效有很大影響，要根據(jù)樣品蛋白質(zhì)的性質(zhì)選擇合適的pH值。

緩沖溶液中通過添加篩分介質(zhì)，運(yùn)行緩沖溶液的粘度變大，需要增長進(jìn)樣前緩沖液沖洗平衡毛細(xì)管的時間。通過進(jìn)樣后的加壓分析研究，發(fā)現(xiàn)分離結(jié)果并未得到實(shí)質(zhì)改善，原因尚未明確，需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證；添加適當(dāng)比例的有機(jī)溶劑如甲醇，可以減小溶液粘度，降低焦耳熱，從而改善峰形，添加比例增大時，峰形變差，遷移時間延長。

3 結(jié)束語

毛細(xì)管電泳分離蛋白質(zhì)具有其高效、快速、樣品量少、溶劑量少等特點(diǎn)，但對于實(shí)際蛋白質(zhì)研究還存在一些問題，如吸附問題、分辨率問題、復(fù)雜組分的干擾等。各種新的分離模式和探索正在進(jìn)行中。毛細(xì)管電泳無膠篩分蛋白質(zhì)的研究目前在國內(nèi)外的報(bào)道還不太多，而篩分機(jī)理還不明確，因此進(jìn)一步的研究十分有意義。目前的研究主要是在篩分介質(zhì)的選擇和分離條件上的改進(jìn)，建立更多的分離模式，使其具有實(shí)用性，并用于蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)組學(xué)研究有著廣闊的發(fā)展前景。

參考文獻(xiàn)

[1]丁文靜，許旭.基于纖維素衍生物的毛細(xì)管無膠篩分電泳及其應(yīng)用[J].分析科學(xué)學(xué)報(bào)，2004，20（2）：204-209.

[2]周欣.高分子材料在無膠篩分毛細(xì)管電泳中的應(yīng)用[J].醫(yī)學(xué)綜述，2006，12（7）：437-438.

[3]郭栩，余勝兵.毛細(xì)管無膠篩分電泳涂漬柱的制備和性能考察[J].分析化學(xué)，1996，24（7）：853-857.

[4]李克，袁倚盛.高效毛細(xì)管區(qū)帶電泳法分離人血清蛋白質(zhì)的研究[J].色譜，2000，18 （2）：152-154.

[5]張振中，吳逸明.無膠篩分毛細(xì)管電泳在蛋白質(zhì)分離中的應(yīng)用[J].河南醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2000，35（3）：230-232.，

[6]趙京山，溫進(jìn)坤.無膠篩分毛細(xì)管電泳檢測微量蛋白質(zhì)方法的建立與評價[J].河北醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2005，26（2）：27-128.endprint