均勻設(shè)計法優(yōu)選通心舒顆粒中藥材的提取工藝

劉 弘，王俊杰（解放軍第152中心醫(yī)院，河南 平頂山 467000）

通心舒顆粒是由人參、丹參、赤芍、當歸、川芎、黃芪等8味中藥組成的臨床驗方，具活血化瘀、行氣止痛之功效，臨床主要用于治療瘀血內(nèi)停所致的胸痹心痛、胸悶刺痛等胸痹癥，療效顯著，不良反應(yīng)少。為制定科學、合理的提取工藝，筆者根據(jù)處方中藥物的藥理作用及有效成分的理化性質(zhì)，結(jié)合中醫(yī)配伍原則及臨床用藥特點，采用均勻設(shè)計安排試驗，以丹酚酸B、芍藥苷為指標成分，運用SPSS統(tǒng)計軟件處理試驗數(shù)據(jù)，優(yōu)選通心舒顆粒水提工藝，為實際生產(chǎn)提供參考。

1 材料

1.1 儀器

LC-20 AT高效液相色譜（HPLC）儀，包括LC-20 ATvp溶劑輸送泵、SCIENCE AT-330柱溫箱、SIL-20 A自動進樣器、SPD-M20 A二極管陣列檢測器、LC solution色譜工作站（日本島津公司）。

1.2 藥材與試劑

處方中各藥材由解放軍第152中心醫(yī)院中藥房提供，經(jīng)解放軍第152中心醫(yī)院趙國景副主任中藥師鑒定為真品；丹酚酸B、芍藥苷對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號分別為111562-200706、110753-200413）；甲醇、乙腈、磷酸均為色譜純，水為純化水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 丹酚酸B、芍藥苷的含量測定

2.1.1 色譜條件[1-4]色譜柱:WondasilTM C18（150mm×4.6mm，5μm），流動相:乙腈-0.1%磷酸鹽緩沖液（梯度洗脫程序見表1）；流速:0.8ml/min；柱溫:30Ⅸ；檢測波長:286（丹酚酸B）、230（芍藥苷）nm；進樣量:10μl。

2.1.2 混合對照品溶液的制備 稱取丹酚酸B、芍藥苷對照品適量，加甲醇制成質(zhì)量濃度分別為215、208μg/ml的混合對照品溶液。

表1 梯度洗脫程序Tab 1 Gradient elution

2.1.3 供試品溶液的制備 精密吸取各提取液10ml，置25ml量瓶中，甲醇定容，搖勻，用0.45μm微孔濾膜濾過，即得。

2.1.4 線性關(guān)系考察 精密量取丹酚酸B、芍藥苷混合對照品溶液2、6、10、14、15、20、25μl，按上述色譜條件進樣測定，記錄峰面積積分值。以對照品進樣量（x）為橫坐標，峰面積積分值（y）為縱坐標，進行線性回歸，得丹酚酸B、芍藥苷的回歸方程分別為y＝1476174.7946 x－13688.9872（r＝0.9999）、y＝1506577.2003 x+78568.9644（r＝0.9998）。結(jié)果表明，丹酚酸B、芍藥苷的進樣量分別在0.416～4.160、0.430～5.375μg范圍內(nèi)與各自峰面積積分值呈良好線性關(guān)系。

2.1.5 精密度試驗 精密吸取丹酚酸B、芍藥苷混合對照品溶液適量，按上述色譜條件重復(fù)進樣測定6次，每次10μg。結(jié)果顯示，丹酚酸B、芍藥苷的RSD分別為1.29%、1.36%（n均為6），表明儀器精密度良好。

2.1.6 穩(wěn)定性試驗 取供試品溶液適量，分別在0、2、4、6、8、16、24h進樣10μl，按上述色譜條件測定。結(jié)果顯示，丹酚酸B、芍藥苷的RSD分別為1.72%、1.16%（n均為7），表明供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.7 重復(fù)性試驗 取同一批提取液適量，按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，再按上述色譜條件進樣測定6次，每次10μl，測定丹酚酸B、芍藥苷峰面積。結(jié)果，丹酚酸B、芍藥苷的RSD分別為0.83%、0.96%（n均為6），表明方法重復(fù)性良好。

2.1.8 加樣回收率試驗 精密稱取已知丹酚酸B（3.2mg/g）、芍藥苷（1.3mg/g）含量的通心舒顆粒樣品1.5 g，共9份，精密加入樣品中各成分質(zhì)量分數(shù)為80%、100%、120%的丹酚酸B、芍藥苷對照品，按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，再按上述色譜條件測定丹酚酸B、芍藥苷含量，并計算加樣回收率。結(jié)果表明，丹酚酸B、芍藥苷的平均加樣回收率分別為1.28%、0.51%，RSD分別為1.28%、0.51%（n均為9）。

2.2 均勻設(shè)計優(yōu)選提取工藝

2.2.1 試驗設(shè)計 根據(jù)實際生產(chǎn)及相關(guān)文獻[5-6]，結(jié)合處方中各藥味的理化性質(zhì)，先取處方量人參、丹參進行醇提，將醇提后殘渣與方中剩余處方量藥材混合，以加水倍數(shù)（A）、浸泡時間（B）、提取時間（C）、提取次數(shù)（D）為考察因素，前3個因素擬定為7個水平，提取次數(shù)擬定為3個水平；以丹酚酸B、芍藥苷轉(zhuǎn)移率（轉(zhuǎn)移率＝提取液中指標成分含量/藥材中指標成分含量×100%，1 g丹參中含丹酚酸B的量為56.5mg，1 g赤芍中含芍藥苷的量為22.0mg）和干膏得率（干膏得率＝干膏質(zhì)量/干膏中所含藥材質(zhì)量×100%）為評價指標，選擇均勻設(shè)計U7（73×3）表進行試驗。因素與水平見表2；均勻設(shè)計試驗結(jié)果見表3。

表2 因素與水平Tab 2 Factors and levels

表3 均勻設(shè)計試驗結(jié)果Tab 3 Results of uniform design

2.2.2 數(shù)據(jù)處理及結(jié)果優(yōu)化[7-9]中藥制劑成分復(fù)雜，對工藝的評價一般借助于試驗數(shù)據(jù)的優(yōu)化處理。筆者采用層次分析加權(quán)法（AHP）優(yōu)化試驗數(shù)據(jù)，通過分析處方配伍理論，根據(jù)“君臣佐使”原則，明確指標成分權(quán)重系數(shù)，計算初始權(quán)重系數(shù)并對其進行一致性檢驗（CR）。指標成分權(quán)重系數(shù)分配見表4。

表4 指標成分權(quán)重系數(shù)分配Tab 4 Distribution of weight coefficient of the components

根據(jù)表4安排，對各試驗結(jié)果計算綜合得分率，結(jié)果1～7號試驗的綜合得分率分別為76.58%、80.21%、61.57%、76.96%、42.55%、45.95%、91.75%。采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件對上述試驗結(jié)果進行回歸分析，以各影響因素為自變量，以指標成分綜合得分為因變量，得回歸方程為Y＝－4.383+2.516 A－0.085 B+0.098 C+19.791 D，復(fù)相關(guān)系數(shù)R＝0.979，F(xiàn)＝11.639，P＜0.05，表明方程具有統(tǒng)計學意義。由方程可知，加水倍數(shù)、提取時間、提取次數(shù)與提取效果呈正相關(guān)，浸泡時間與提取效果呈負相關(guān)，且影響大小為提取次數(shù)＞加水倍數(shù)＞提取時間＞浸泡時間。結(jié)合各試驗水平下綜合得分結(jié)果，雖處方7得分最高，但考慮到實際生產(chǎn)條件及經(jīng)濟性，最終確定最佳提取工藝為加9倍量的水，浸泡20min，提取3次，每次105min。

2.3 工藝驗證試驗

取人參、丹參醇提后殘渣與方中剩余處方量藥材混合，采用上述優(yōu)選的工藝制備供試品溶液，再按“2.1”項下方法測定丹酚酸B、芍藥苷含量，計算干膏得率和各指標成分的轉(zhuǎn)移率。結(jié)果，各評價指標與正交試驗最高值相當，表明優(yōu)選的工藝重復(fù)性好，穩(wěn)定、可行。工藝驗證試驗結(jié)果見表5。

表5 工藝驗證試驗結(jié)果Tab 5 Results of validation test of technology

3 討論

中藥復(fù)方制劑成分復(fù)雜，在工藝篩選中選取單一成分作為指標，難免出現(xiàn)片面性。中醫(yī)藥理論指導(dǎo)下的中藥制劑，療效的發(fā)揮是多種有效成分共同作用的結(jié)果。因此，多指標共同考察工藝參數(shù)，不僅能反映制劑的工藝水平，且能在一定程度上反映所用藥材的質(zhì)量，同時指標成分的分離測定還可以綜合反映傳統(tǒng)中藥組方的配伍狀況，這既考慮到中醫(yī)臨床用藥的習慣，又符合質(zhì)量控制的要求。

均勻設(shè)計在中藥制劑工藝優(yōu)選研究中應(yīng)用廣泛，各試驗具備在試驗點范圍內(nèi)充分的均勻分散的特點。因此，應(yīng)保證試驗條件的可比性，準確選擇考察因素，恰當?shù)卮_定各因素的考查范圍，合理劃分因素水平，同一因素各水平之間的差距應(yīng)足夠大，水平之間的差距對評價指標的影響越顯著，回歸分析結(jié)果的精確性就越高；同時應(yīng)該嚴格控制試驗誤差，均勻設(shè)計的結(jié)果才準確、可靠。本試驗在查閱相關(guān)文獻并結(jié)合實際生產(chǎn)的情況下，選取對提取效率影響較大的加水量、浸泡時間、提取時間及提取次數(shù)為因素，合理選擇各因素水平，通過優(yōu)化分析，最終得出經(jīng)濟、簡便、合理、實用的提取工藝。

采用AHP優(yōu)化試驗數(shù)據(jù)，較其他方法更為科學、合理的解決綜合評價中權(quán)重系數(shù)選擇問題，但在層次分析時應(yīng)注意一些不足和弊端:指標不能一味增大；AHP僅限于評價指標在9個之內(nèi)；各指標的權(quán)重數(shù)值大小需結(jié)合專業(yè)知識及研究目的來確定，且需要進一步進行CR。SPSS統(tǒng)計軟件回歸分析結(jié)果可以很好地預(yù)測及確定最佳工藝水平，驗證試驗結(jié)果表明，選取的各參數(shù)準確、可靠。

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