正交試驗優(yōu)選板藍根多肽的提取工藝Δ

南楠，劉西京，侯安國（1.深圳職業(yè)技術學院應用化學與生物技術學院，廣東 深圳 518055；.云南中醫(yī)學院中藥學院，昆明 650500）

板藍根為十字花科植物菘藍Isatis indigotica Fort.的干燥根，具有清熱解毒、涼血利咽之功效[1]。長期以來，研究人員對板藍根的藥效物質基礎進行了大量的研究，部分研究認為板藍根中的游離氨基酸是有效成分[2-3]。2010年版《中國藥典》（一部）也對板藍根中游離氨基酸進行了定性鑒別[4]。筆者在研究中發(fā)現(xiàn)，板藍根中多肽含量較高，經(jīng)人工胃腸液消化后，通過十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）法檢測發(fā)現(xiàn)，板藍根多肽被降解成小分子多肽，而不是降解成游離氨基酸。整體藥理試驗也表明，板藍根多肽有抗流感病毒的作用（另文發(fā)表），因此多肽可能為板藍根的主要物質基礎之一，故有必要對板藍根多肽的提取工藝進行優(yōu)化。筆者采用正交試驗，以新版國家標準凱氏定氮法和2，2′-聯(lián)喹啉-4，4′-二甲酸二鈉鹽（BCA）法測定多肽含量，考察提取溶劑、提取時間、溶劑用量對多肽提取的影響，并對這兩種測定方法進行比較。

1 材料

1.1 儀器

KDN-04 A型半自動凱氏定氮儀（上海貝特儀電設備廠）；Multiskan spectrum全波長酶標儀（美國Thermo公司）；96孔板（美國康寧公司）；MF1-A10超純水機（美國Millipore公司）；5180 R高速離心機（德國Eppendorf公司）。

1.2 藥材

板藍根，2011年10月購自甘肅，經(jīng)湖南省中醫(yī)研究院劉春海副研究員鑒定為真品。

1.3 試劑

BCA蛋白濃度測定試劑盒（增強型，碧云天生物技術研究所）；其他化學試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 藥材的提取

板藍根藥材適當粉碎，過40目篩，稱取50 g，按試驗安排在常溫下進行浸取。用紗布粗濾，以離心半徑為8 cm、6000 r/min離心10min，取上清液。平行試驗2次。

2.2 板藍根多肽的含量測定

2.2.1 凱氏定氮法 按國家標準GB 5009.5-2010版凱氏定氮法，精密吸取上清液10ml，依法測定板藍根浸提液中多肽含量，計算多肽得率（多肽得率＝提取的多肽質量/板藍根質量×100%）。

2.2.2 BCA法 別精密吸取1、2、4、8、12、20μl的1mg/ml牛血清白蛋白（BSA）標液，加于96孔板中，加水補足20μl，各孔加入200μl BCA工作液，放入酶標儀中，在562nm波長下檢測。設定程序如下:振蕩30 s，在37Ⅸ下孵育15min。以BSA質量濃度（x）為橫坐標，吸光度（y）為縱坐標，進行線性回歸，得回歸方程為y＝0.010 x+0.146（r＝0.9989）。結果表明，BSA質量濃度在0～90.909μg/ml范圍內(nèi)與吸光度呈良好線性關系。

2.2.3 樣品含量測定 精密吸取上清液40μl，加超純水于1ml量瓶中，吸取20μl加入96孔板中，然后加入200μl BCA工作液，按“2.2.1”、“2.2.2”項下方法測定。

2.3 正交試驗優(yōu)選工藝

根據(jù)預試驗和筆者經(jīng)驗，選取溶劑種類（A）、提取時間（B）、溶劑用量（C）為考察因素，以多肽得率為評價指標，采用L9（34）正交表進行試驗。因素與水平見表1；正交試驗結果見表2；方差分析結果見表3。

表1 因素與水平Tab 1 Factors and levels

表2 正交試驗結果Tab 2 Results of orthogonal test

表3 方差分析結果Tab 3 Analysis of variance

由表2、表3可知，采用凱氏定氮法測定時，各因素對多肽得率的影響順序為B＞A＞C，因素A、B對多肽得率的影響有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），最佳提取工藝為A1B3C3，即用15倍量超純水浸泡24h。采用BCA法測定時，各因素對多肽得率的影響順序為A＞C＞B，其中因素A對多肽得率的影響有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），最佳提取條件為A1B1C3，即用15倍量超純水浸泡6h?？紤]到在BCA法中B對結果的影響最小，而在凱氏定氮法中B對結果有較大影響，綜合考慮，選取最佳提取工藝為A1B3C3，即用15倍量超純水浸泡24h。

2.4 工藝驗證試驗

取5000 g板藍根藥材粗粉，共3份，按上述優(yōu)選的工藝進行提取，照凱氏定氮法和BCA法測定多肽得率。結果，多肽得率分別為10.58%和6.32%，收率可達70%以上，表明所選工藝穩(wěn)定、可行，可用于板藍根中多肽的提取。

3 討論

蛋白或多肽的測定方法有多種，又各有優(yōu)缺點[5-9]，如紫外吸收法操作簡便快速，但準確度較差；Folin-酚試劑法靈敏度高，對蛋白質和分子質量較小的多肽具有同樣的顯色反應，但干擾物較多，檢出的蛋白含量往往偏高；考馬斯亮藍法靈敏度高，但標準蛋白質選擇困難，且對于大量多肽成分存在的溶液不宜用；雙縮脲法靈敏度較低，需要的樣品量大；凱氏定氮法是測定蛋白或多肽最經(jīng)典的方法，但本法耗時較長，且含氮的非蛋白質化合物、游離氨基酸等干擾物在樣品中普遍存在；BCA法靈敏度高，對于溶液中低含量的多肽也可檢出，且干擾物質少。

筆者根據(jù)板藍根的特性，選擇凱氏定氮法與BCA法同時測定蛋白質含量，相互驗證，以求結果的準確、科學。從試驗結果可以看出，兩種方法測得的多肽得率相近，凱氏定氮法結果稍偏高，原因是板藍根浸提液里除了蛋白質和多肽外，還含有很多含氮化合物，如生物堿、核苷類、游離氨基酸類等，換言之，凱氏定氮法的結果是多肽、生物堿、核苷類、游離氨基酸的總和，故測量值偏高。BCA法靈敏度高，干擾少，測定結果相對較準確。兩種方法的測定結果差距不大，也說明了在提取液中多肽的含量較高。筆者所在課題組已證實多肽有一定的抗流感病毒作用，因此其在板藍根“清熱解毒”中的作用不應忽視。

一般來說，堿性蛋白或肽采用酸性緩沖溶液提取，酸性蛋白或肽采用堿性緩沖液提取。試驗中因不能確定板藍根中肽的等電點，因此在正交試驗設計中采用pH8.0和pH6.0的磷酸鹽緩沖液進行提取，測量酸堿兩性緩沖溶液和超純水對總蛋白提取效率的影響。結果顯示，無論凱氏定氮法還是BCA法，K2A結果較K3A均偏低，說明偏堿性緩沖液比偏酸性緩沖液提取的多肽得率低，推測板藍根酸性蛋白或肽含量可能低于堿性蛋白或肽。

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[3]孫秀霞，張麗莉，孫翠蘭.板藍根抗病毒有效部位研究[J].中國藥理學通報，2007，23（6）:835.

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