婦血康顆粒的促排卵作用Δ

付書(shū)婕，李迪，黃增瓊，巫玲玲，蔣偉哲（廣西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，南寧 530021）

婦血康顆粒是根據(jù)民間臨床經(jīng)驗(yàn)，采用廣西地區(qū)獨(dú)有的天然名貴草藥滇桂艾納香（Blumea riparia（Bl.）DC.）作為主藥，經(jīng)現(xiàn)代科學(xué)工藝濃縮精煉而成的純中藥制劑，是一種療效確切，安全無(wú)毒副作用的婦科、產(chǎn)科血癥止血藥。臨床研究表明，婦血康顆粒對(duì)流產(chǎn)后子宮出血不凈（血瘀證）療效確切。其中，君藥滇桂艾納香具有補(bǔ)血活血、祛瘀生新、斂血止血之功效，能促進(jìn)子宮平滑肌收縮，使血管閉合，加快子宮內(nèi)膜脫落，具有很好的止血作用[1]。中藥復(fù)方治療月經(jīng)失調(diào)、功能性不孕等下丘腦-垂體-卵巢（HPO）軸功能失調(diào)性疾病由來(lái)已久，而對(duì)其藥效學(xué)研究始于20世紀(jì)80年代[2]。目前，有關(guān)婦血康顆粒的促排卵作用研究尚未見(jiàn)報(bào)道，本課題組首次采用未成年大鼠自然條件下HPO軸功能不健全模型，觀察婦血康顆粒對(duì)大鼠排卵的影響，并探討其相關(guān)機(jī)制，為充分利用廣西特色藥材資源提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

FMA-87型全自動(dòng)放免γ計(jì)數(shù)器（上海技術(shù)監(jiān)督局實(shí)驗(yàn)工廠）；SZX10型顯微鏡（日本Olympus公司）；BS110 S型電子天平（德國(guó)Sartorius公司）；HP8453型分光光度計(jì)（美國(guó)Agilent公司）；Fj-200型高速分散均質(zhì)機(jī)（上海標(biāo)本模型廠）。

1.2 藥品與試劑

婦血康干膏粉（廣西桂西制藥有限公司，批號(hào):110510，0.7 g干膏粉相當(dāng)于10 g婦血康顆粒）；己烯雌酚（合肥久聯(lián)制藥有限公司，批號(hào):20110102，規(guī)格:0.5mg/片）；ERα（MC-20）兔抗大鼠多克隆抗體（一抗，批號(hào):SC-542）、兔二步法檢測(cè)試劑盒（二抗，批號(hào):SC-658）均購(gòu)自美圖Santa Cruz公司；DAB顯色試劑盒（批號(hào):110820）、孕激素（P）放射免疫試劑盒（批號(hào):110912）、雌二醇（E2）放射免疫試劑盒（批號(hào):111015）、黃體生成素（LH）放射免疫試劑盒（批號(hào):111020）、促卵泡激素（FSH）放射免疫試劑盒（批號(hào):110723）均購(gòu)自北方生物技術(shù)研究所。

1.3 動(dòng)物

SPF級(jí)Wistar未成年大鼠40只，♀，6～7周齡，體質(zhì)量95～110 g，購(gòu)自廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào):SCXK（桂）2009-0002]。

2 方法

2.1 分組、給藥與標(biāo)本取材

40只大鼠隨機(jī)均分為4組，即正常對(duì)照（等容生理鹽水）組、己烯雌酚（1mg/kg）組與婦血康高、低劑量（400、100mg/kg）組。ig給藥，每天1次，連續(xù)14 d。于末次給藥1 h后，拔眼球采血3ml，置于未加抗凝的試管中，靜置20min，以離心半徑為8 cm、3000 r/min離心20min，取血清，－80Ⅸ貯藏，備用。

2.2 性激素指標(biāo)測(cè)定

通過(guò)放射免疫分析法常規(guī)測(cè)定大鼠血清FSH、LH、E2和P的水平，按照相應(yīng)試劑盒的方法步驟分別測(cè)定。

2.3 卵泡成熟總數(shù)計(jì)算與卵巢、子宮的組織形態(tài)觀察

處死大鼠，剖取卵巢、子宮，分別稱定質(zhì)量后固定于10%甲醛內(nèi)，常規(guī)脫水，包埋，6 μm切片，蘇木精-伊紅（HE）染色，光鏡觀察卵巢、子宮的組織形態(tài)變化。卵泡成熟總數(shù)以每只大鼠雙側(cè)卵巢切片中黃體數(shù)與成熟卵泡數(shù)相加之和計(jì)。通過(guò)顯微鏡觀察大鼠卵巢、子宮的組織形態(tài)學(xué)。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 婦血康顆粒對(duì)大鼠血清FSH、LH、E2和P水平的影響

與正常對(duì)照組比較，婦血康高劑量組大鼠血清LH活性增強(qiáng)，E2、P含量減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；婦血康低劑量組大鼠血清LH活性增強(qiáng)，F(xiàn)SH活性減弱，P含量減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。婦血康顆粒對(duì)大鼠血清FSH、LH、E2和P水平的影響見(jiàn)表1。

表1 婦血康顆粒對(duì)大鼠血清FSH、LH、E2和P水平的影響（，n＝10）Tab 1 Comparison of the leves of FSH，LH，E2and P in serum of model rats among those groups（，n＝10）

表1 婦血康顆粒對(duì)大鼠血清FSH、LH、E2和P水平的影響（，n＝10）Tab 1 Comparison of the leves of FSH，LH，E2and P in serum of model rats among those groups（，n＝10）

與正常對(duì)照組比較:＊P＜0.05vs.normal control group:＊P＜0.05

組別正常對(duì)照組己烯雌酚組婦血康低劑量組婦血康高劑量組P，n g/ml 27.00±8.9519.25±7.95＊15.33±10.50＊11.56±9.70＊?jiǎng)┝?，mg/k g 1100400 FSH，mu/ml 0.76±0.340.60±0.330.46±0.24＊0.77±0.33 LH，mu/ml 0.38±0.470.83±0.81＊1.31±0.58＊2.15±0.82＊E2，p g/ml 1284±3221275±3291062±263987±371＊

3.2 婦血康顆粒對(duì)大鼠成熟卵泡總數(shù)的影響

與正常對(duì)照組比較，婦血康高、低劑量組大鼠成熟卵泡總數(shù)增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01或P＜0.05）。婦血康顆粒對(duì)大鼠成熟卵泡總數(shù)的影響見(jiàn)表2。

3.3 婦血康顆粒對(duì)大鼠卵巢組織形態(tài)學(xué)的影響

大體觀察到己烯雌酚組大鼠卵巢略大，顏色較深；婦血康高、低劑量組與正常對(duì)照組無(wú)明顯差異。鏡下觀察到正常對(duì)照組可見(jiàn)較多原始、初級(jí)、次級(jí)卵泡，成熟卵泡較少見(jiàn)，偶見(jiàn)黃體；婦血康高、低劑量組可見(jiàn)各級(jí)卵泡，成熟卵泡略增，黃體增多，顆粒細(xì)胞層變厚；己烯雌酚組可見(jiàn)各級(jí)卵泡，較多的成熟卵泡，黃體增多，卵細(xì)胞清晰可見(jiàn)，顆粒細(xì)胞層明顯增厚。大鼠卵巢組織形態(tài)學(xué)變化見(jiàn)圖1、圖2。

表2 婦血康顆粒對(duì)大鼠成熟卵泡總數(shù)的影響（，n＝10）Tab 2 Comparison of the amount of mature follicle of rats among those groups（，n＝10）

表2 婦血康顆粒對(duì)大鼠成熟卵泡總數(shù)的影響（，n＝10）Tab 2 Comparison of the amount of mature follicle of rats among those groups（，n＝10）

與正常對(duì)照組比較:＊P＜0.05，＊＊P＜0.01vs.normal control group:＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

劑量，mg/k g組別正常對(duì)照組己烯雌酚組婦血康低劑量組婦血康高劑量組1100400卵泡成熟總數(shù)/個(gè)5.12±1.649.37±2.87＊＊7.50±1.31＊8.25±2.76＊＊

圖1 大鼠卵巢組織形態(tài)學(xué)變化（HE，100×）A.正常對(duì)照組；B.婦血康低劑量組；C.婦血康高劑量組；D.己烯雌酚組Fig 1 Morphology change of ovarian tissue of rats among those groups（HE，100×）A.normal control group；B.Fuxuekang low-dose group；C.Fuxuekang high-dose group；D.diethylstilbestrol group

3.4 婦血康對(duì)大鼠子宮組織形態(tài)學(xué)的影響

大體觀察到己烯雌酚組大鼠子宮輕度充血，明顯增粗、子宮長(zhǎng)度沒(méi)有明顯變化；婦血康高、低劑量組與正常對(duì)照組無(wú)明顯差異，大鼠子宮外觀色白，直徑較細(xì)。鏡下觀察到正常對(duì)照組大鼠子宮管壁較薄，黏膜較薄，固有層結(jié)締組織較致密，腺體較少，腺腔小，上皮細(xì)胞呈柱狀，排列緊密；婦血康高、低劑量組大鼠子宮內(nèi)腺體數(shù)目略增多，略大，其他不太明顯；己烯雌酚組大鼠子宮內(nèi)膜增厚明顯，組織疏松，子宮腺體增多、變大，上皮細(xì)胞高柱狀排列，間質(zhì)內(nèi)有水腫。大鼠子宮組織形態(tài)學(xué)變化見(jiàn)圖3。

4 討論

圖2 大鼠卵巢組織形態(tài)學(xué)變化（HE，200×）A.正常對(duì)照組；B.婦血康低劑量組；C.婦血康高劑量組；D.己烯雌酚組Fig 2 Morphology change of ovarian tissue of rats among those groups（HE，200×）A.normal control group；B.Fuxuekang low-dose group；C.Fuxuekang high-dose group；D.diethylstilbestrol group

圖3 大鼠子宮組織形態(tài)學(xué)變化（HE，400×）A.正常對(duì)照組；B.婦血康低劑量組；C.婦血康高劑量組；D.己烯雌酚組Fig 3 Morphology change of uterus of rats among those groups（HE，400×）A.normal control group；B.Fuxuekang low-dose group；C.Fuxuekang high-dose group；D.diethylstilbestrol group

在卵泡發(fā)育過(guò)程中，卵泡細(xì)胞表達(dá)的功能性促性腺激素受體是卵泡獲得對(duì)促性腺激素發(fā)生反應(yīng)能力的前提[3]。由于卵泡發(fā)育成熟及成熟卵泡排出是連續(xù)過(guò)程，正常排卵需要完整的HPO軸之間的正常功能，其中任何一個(gè)環(huán)節(jié)失調(diào)，或器質(zhì)性病變，都可造成暫時(shí)或長(zhǎng)期的卵泡發(fā)育障礙、無(wú)排卵[4]。卵泡能否發(fā)育成熟直接關(guān)系到婦女生殖及內(nèi)分泌功能是否正常。在下丘腦促性腺激素釋放激素的作用下，垂體分泌的FSH和LH直接參與卵巢功能的調(diào)節(jié)[5]。FSH主要促進(jìn)卵泡的各種細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育，以利生殖細(xì)胞的成熟，并刺激卵巢顆粒細(xì)胞的增生，使卵泡激素分泌及芳香化酶活化[6]。LH主要作用是促排卵，在卵巢周期中期出現(xiàn)高峰，促使卵泡成熟，排出卵子，使排卵后的卵泡變成黃體，黃體的形成與維持都需要有LH，并能使黃體合成分泌P。FSH是刺激卵泡發(fā)育最重要的激素，可促使竇前卵泡及竇狀卵泡的顆粒細(xì)胞增殖與分化，縫隙連接形成、分泌卵泡液，使卵泡生長(zhǎng)發(fā)育[7]。FSH和LH在卵巢功能調(diào)節(jié)中具有協(xié)同作用[3]。

本研究結(jié)果表明，高、低劑量婦血康顆粒均能明顯增強(qiáng)未成年♀大鼠血清LH活性及增加卵泡成熟總數(shù)。婦血康低劑量組可減弱FSH的活性，但顯微鏡下觀察仍表現(xiàn)為促進(jìn)卵巢的成熟，增加卵泡成熟總數(shù)，可能婦血顆?？当旧砭陀蓄愃艶SH的作用；婦血康高劑量組大鼠血清FSH分泌量無(wú)明顯變化（本研究中接近正常值），提示婦血康顆粒在一定劑量范圍內(nèi)對(duì)FSH活性有減弱作用，具體機(jī)制有待進(jìn)一步探討。

婦血康顆粒能促進(jìn)卵巢的成熟和排卵，促進(jìn)黃體的形成與合成，使單一雌激素作用轉(zhuǎn)為雌、孕激素的共同作用。顯微鏡下觀察可見(jiàn)婦血康對(duì)正常未成年大鼠的子宮組織未有明顯影響，但稍有促進(jìn)子宮向分泌期轉(zhuǎn)化的趨勢(shì)。婦血康顆?？山档徒】荡笫驟2、P的含量，其抑制作用不是通過(guò)FSH及LH而引起的。因此可以推測(cè)婦血康顆粒抑制E2及P的作用機(jī)制是婦血康顆粒與雌激素受體結(jié)合，直接或間接抑制芳香化酶或孕激素合成的關(guān)鍵酶。

婦女進(jìn)入更年期，卵巢功能逐漸減退，分泌的雌激素水平降低，對(duì)下丘腦、垂體的負(fù)反饋?zhàn)饔脺p弱，使下丘腦促性腺激素釋放激素分泌增加，繼而FSH分泌增加，升高的FSH會(huì)加快卵泡成熟的速度，促使雌激素的分泌又增加，因而雌激素水平呈現(xiàn)或高或低的波動(dòng)狀態(tài)[8]。在此變化過(guò)程中。人體不斷地進(jìn)行自身調(diào)節(jié)，使HPO軸達(dá)到一種新的相對(duì)平衡狀態(tài)。E2下降的過(guò)程并非呈線性，而是波動(dòng)性下降，直至最終穩(wěn)定在較低水平，這種雌激素的撤退比雌激素低下本身更為重要[9]。婦女更年期這種HPO軸功能的失調(diào)，不僅影響了其有關(guān)激素的效應(yīng)器官功能，而且直接或間接地影響了植物神經(jīng)系統(tǒng)，引起全身一系列復(fù)雜的病理改變，導(dǎo)致更年期綜合征的發(fā)生[10]。

筆者選擇未成年大鼠作為HPO軸及靶器官結(jié)構(gòu)功能調(diào)節(jié)模型，是因?yàn)槠銱PO軸調(diào)節(jié)功能不健全，沒(méi)有正常卵巢周期。而未成年大鼠是自然條件下HPO軸功能不健全的模型，未成年大鼠HPO軸及靶器官反應(yīng)靈敏，便于觀察效果；未成年大鼠來(lái)源充足，周齡、體質(zhì)量等生理狀況容易控制在同一水平，可減少實(shí)驗(yàn)的系統(tǒng)誤差。

本研究發(fā)現(xiàn)，婦血康顆粒能夠使大鼠血清E2含量減少，下丘腦弓狀核雌激素受體升高，使局部下丘腦神經(jīng)肽Y水平降低，促性腺激素釋放激素分泌升高，從而使FSH活性減弱，LH活性增強(qiáng)，促進(jìn)排卵。綜上所述，婦血康顆粒能通過(guò)多環(huán)節(jié)、多靶點(diǎn)發(fā)揮促排卵作用，其調(diào)節(jié)HPO軸功能的作用是婦血康顆粒的重要藥理作用之一，為臨床防治生殖內(nèi)分泌平衡失調(diào)性疾病提供了藥理學(xué)基礎(chǔ)。本研究對(duì)藥效學(xué)深入研究，為拓展企業(yè)優(yōu)勢(shì)產(chǎn)品婦血康顆粒的新用途——促進(jìn)卵泡成熟及排卵作用提示了一個(gè)研究方向。但是，婦血康顆粒促進(jìn)排卵的作用機(jī)制可能是多方面的，有待進(jìn)一步系統(tǒng)、細(xì)致的研究。

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