芩術四物湯中抗痛經有效成分的篩選Δ

黃道秋，牟華明，秦旭華，彭騰，萬維海，賀元元，楊力（1.重慶三峽中心醫(yī)院，重慶 404000；.成都中醫(yī)藥大學藥學院，成都 61007）

痛經亦稱經行腹痛，是婦科臨床常見多發(fā)病，嚴重影響廣大婦女正常的學習、工作和生活。對于此癥西醫(yī)并無特效治療方法，常用的非甾體抗炎藥可引起消化道潰瘍，其發(fā)生率為15%～30%，其次為肝腎損害，嚴重者可導致患者死亡[1]。據統計，在美國每年大約有107000例由非甾體抗炎藥引起的嚴重消化道損傷和16500例與非甾體抗炎藥相關的死亡[2]。中醫(yī)學在本病的治療方面有著悠久的歷史，積累了豐富的臨床經驗，同時傳統中藥具有療效好、副作用少的特點[3]。因此，對痛經經驗方芩術四物湯進行藥效物質基礎的深入研究不僅是中醫(yī)藥現代研究的需要，更是臨床的迫切需求。本研究采用有機溶劑系統分離提取法，將芩術四物湯分為乙酸乙酯、正丁醇、水提取物，以縮宮素復制小鼠痛經模型為對象，初步確定芩術四物湯治療痛經的有效部位；在此基礎上對其有效部位再次進行分離提取，通過藥效學實驗進一步篩選其有效成分。

1 材料

1.1 儀器

DSY-1-2型電熱恒溫水浴鍋（北京國華醫(yī)療器械廠）；SHB-Ⅸ型循環(huán)水式多用真控泵（鄭州長城科工貿有限公司）；BUG25-12型超聲波清洗器（必能信超聲上海有限公司）；FA2004 N型電子天平（上海民怡儀器有限公司）。

1.2 藥品與試劑

芩術四物湯乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物、水提取物、漢黃芩素、黃芩素、沒食子酸、黃芩苷均由成都中醫(yī)藥大學中藥化學教研室彭騰副教授提供；己烯雌酚片（合肥久聯制藥有限公司，批號:20130208）；縮宮素注射液（河南輔仁懷慶堂制藥有限公司，批號:20121217）；布洛芬膠囊（中美天津史克制藥有限公司，批號:09100248）；前列環(huán)素（PGF）2 α測試盒（美國Sigma公司）。

1.3 動物

SPF級KM種小鼠，♀，體質量18～22 g，由成都中醫(yī)藥大學動物實驗中心提供[實驗動物使用合格證號:SCXK（川）2008-11]。

2 方法

2.1 芩術四物湯提取物對模型小鼠（縮宮素誘發(fā)）扭體反應的影響

[4-5]方法，將小鼠ig己烯雌酚（2mg/kg），每天1次，連續(xù)12 d，人工促使其處于動情期或動情前期，以提高小鼠子宮平滑肌對縮宮素的敏感性，末次ig己烯雌酚60min后ip縮宮素20 u/kg以復制小鼠痛經模型。80只小鼠隨機均分為8組，即模型（等容含0.5%吐溫80的蒸餾水）組，布洛芬（180mg/kg）組，芩術四物湯乙酸乙酯提取物高、低劑量（230、120mg/kg）組，芩術四物湯正丁醇提取物高、低劑量（1040、520mg/kg）組，芩術四物湯水提取物高、低劑量（3000、1500mg/kg）組。ig己烯雌酚第6天時開始ig給藥，每天1次，連續(xù)7 d。觀察ip縮宮素30min內小鼠扭體反應次數，并計算抑制率。抑制率%＝（模型組扭體反應次數－給藥組扭體反應次數）/模型組扭體反應次數。

2.2 芩術四物湯乙酸乙酯提取物中單體化合物對模型小鼠（縮宮素誘發(fā)）扭體反應的影響

復制模型同“2.1”項下方法。100只小鼠隨機均分為10組，即模型（等容含0.5%吐溫-80的蒸餾水）組，布洛芬（180mg/kg）組，漢黃芩素高、低劑量（134、67mg/kg）組，黃芩素高、低劑量（144、72mg/kg）組，沒食子酸高、低劑量（68.6、34.3mg/kg）組，黃芩苷高、低劑量（120、60mg/kg）組。給藥方法與測定指標同“2.1”項下方法。

2.3 沒食子酸與黃芩苷對模型小鼠（PGF2 a誘發(fā)）扭體反應的影響

小鼠ig己烯雌酚（2mg/kg），每天1次，連續(xù)12 d，人工促使其處于動情期或動情前期，以提高小鼠子宮平滑肌對PGFα的敏感性，末次ig己烯雌酚60min后ip PGF2 a 1.3mg/kg以復制小鼠痛經模型。80只小鼠隨機均分為8組，即模型（等容含0.5%吐溫80的蒸餾水）組，布洛芬（180mg/kg）組，沒食子酸高、中、低劑量（68.6、34.3、17.2mg/kg）組，黃芩苷高、中、低劑量（120、60、30mg/kg）組。給藥方法與測定指標同“2.1”項下方法。

2.4 統計學方法

3 結果

3.1 芩術四物湯提取物對模型小鼠（縮宮素誘發(fā)）扭體反應的影響

與模型組比較，芩術四物湯乙酸乙酯提取物高、低劑量組與芩術四物湯正丁醇提取物高劑量組小鼠扭體次數減少，抑制率升高，差異有統計學意義（P＜0.01或P＜0.05），表明芩術四物湯乙酸乙酯提取物抑制痛經作用較強。芩術四物湯提取物對模型小鼠（縮宮素誘發(fā)）扭體反應的影響見表1。

表1 芩術四物湯提取物對模型小鼠（縮宮素誘發(fā)）扭體反應的影響（，n＝10）Tab 1 Effect of different extracts of Qinshu siwutang of writhing response in mode（linduced by Oxytocin）mice（，n＝10）

表1 芩術四物湯提取物對模型小鼠（縮宮素誘發(fā)）扭體反應的影響（，n＝10）Tab 1 Effect of different extracts of Qinshu siwutang of writhing response in mode（linduced by Oxytocin）mice（，n＝10）

與模型組比較:＊P＜0.05vs.model group:＊P＜0.05

70.04＊＊59.73＊＊48.67＊50.10＊28.3223.0133.19組別模型組布洛芬組芩術四物湯乙酸乙酯提取物高劑量組芩術四物湯乙酸乙酯提取物低劑量組芩術四物湯正丁醇提取物高劑量組芩術四物湯正丁醇提取物低劑量組芩術四物湯水提取物高劑量組芩術四物湯水提取物低劑量組劑量，mg/k g 抑制率，%180230120104052030001500扭體次數，次/30mi n 22.6±9.36.7±6.8＊＊9.1±7.3＊＊11.6±8.8＊10.6±8.7＊16.2±10.917.4±10.615.1±7.6

3.2 芩術四物湯乙酸乙酯提取物中單體化合物對模型小鼠（縮宮素誘發(fā)）扭體反應的影響

與模型組比較，沒食子酸高、低劑量組與黃芪苷高劑量組小鼠扭體次數減少，抑制率升高，差異有統計學意義（P＜0.05），表明沒食子酸、黃芩苷抑制痛經作用較強。芩術四物湯乙酸乙酯提取物中單體化合物對模型小鼠（縮宮素誘發(fā)）扭體反應的影響見表2。

表2 芩術四物湯乙酸乙酯提取物中單體化合物對模型小鼠（縮宮素誘發(fā)）扭體反應的影響（，n＝10）Tab 2 Effect of ethyl acetate parts of Qinshu siwutang of writhing response in mode（linduced by oxytocin）mice（，n＝10）

表2 芩術四物湯乙酸乙酯提取物中單體化合物對模型小鼠（縮宮素誘發(fā)）扭體反應的影響（，n＝10）Tab 2 Effect of ethyl acetate parts of Qinshu siwutang of writhing response in mode（linduced by oxytocin）mice（，n＝10）

與模型組比較:＊P＜0.05vs.model group:＊P＜0.05

組別模型組布洛芬組漢黃芩素高劑量組漢黃芩素低劑量組黃芩素高劑量組黃芩素低劑量組沒食子酸高劑量組沒食子酸低劑量組黃芩苷高劑量組黃芩苷低劑量組劑量，mg/k g 抑制率，%57.13＊9.3541.0614.6319.1151.63＊45.53＊50.00＊31.71180134671447268.634.312060扭體次數，次/30mi n 24.6±10.110.5±6.8＊22.3±15.814.5±6.521.0±9.019.9±11.211.9±9.8＊13.4±6.5＊12.3±8.7＊16.8±12.3

3.3 沒食子酸與黃芩苷對模型小鼠（PGF2 a誘發(fā)）扭體反應的

影響與模型組比較，沒食子酸高、中劑量組與黃芩苷高、中劑量組小鼠扭體次數減少，抑制率升高，差異有統計學意義（P＜0.01或P＜0.05）。沒食子酸與黃芩苷對模型小鼠（PGF2 a誘發(fā)）扭體反應的影響見表3。

表3 沒食子酸與黃芩苷對模型小鼠（PGF2 a誘發(fā)）扭體反應的影響（，n＝10）Tab 3 Effect of gallic acid and baicalin of writhing response in model（induced by PGF2 a）mice（，n＝10）

表3 沒食子酸與黃芩苷對模型小鼠（PGF2 a誘發(fā)）扭體反應的影響（，n＝10）Tab 3 Effect of gallic acid and baicalin of writhing response in model（induced by PGF2 a）mice（，n＝10）

與模型組比較:＊P＜0.05vs.model group:＊P＜0.05

組別模型組布洛芬組沒食子酸高劑量組沒食子酸中劑量組沒食子酸低劑量組黃芩苷高劑量組黃芩苷中劑量組黃芩苷低劑量組劑量，mg/k g 抑制率，%62.12＊＊58.33＊＊36.87＊16.4247.72＊41.67＊26.2618068.634.317.21206030扭體次數，次/30mi n 39.6±12.415.0±9.9＊＊16.5±10.0＊＊25.0±11.6＊33.1±16.520.7±12.5＊23.1±8.8＊29.2±14.5

4 討論

芩術四物湯是多年臨床經驗的簡化方，由古方芩術丸和四物湯裁減方構成，由黃芩、白術、當歸、川芎、白芍等藥構成。該方藥味精簡，藥物配伍平和而巧妙，養(yǎng)血活血，行氣利水，寓意深刻，凡證見血虛、血瘀、濕阻、肝郁、脾虛等虛實夾雜者，均可用之。該方的物質基礎及藥效學研究在國內均屬空白，因此開展該方面的實驗研究，不僅有可能進一步闡明傳統驗方治療痛經的現代機制，通過現代的分離和提取技術，更有可能從傳統驗方中尋找并開發(fā)出新型安全治療痛經的有效藥物。

本研究顯示芩術四物湯乙酸乙酯提取物在230、120mg/kg劑量下，正丁醇提取物在1040mg/kg劑量下，可明顯對抗縮宮素誘發(fā)的模型小鼠子宮激烈收縮疼痛所致的小鼠扭體反應，與模型組比較差異有統計學意義（P＜0.01或P＜0.05）。通過對比篩選實驗，可初步認為乙酸乙酯部位、正丁醇部位為芩術四物湯治療痛經的有效部位，但乙酸乙酯部位作用更為明顯，在此基礎上對芩術四物湯的乙酸乙酯部位進一步分離，得到了漢黃芩素、黃芩素、沒食子酸、黃芩苷4個單體化合物，并再次進行藥效學的對比篩選。結果表明，沒食子酸在68.6、34.3mg/kg劑量下，黃芩苷在120mg/kg劑量下，均能明顯減少縮宮素與PGF2 α所致痛經小鼠扭體反應次數，與模型對照組比較差異有統計學意義（P＜0.01或P＜0.05）。本研究結果表明，芩術四物湯乙酸乙酯部位的單體成分沒食子酸、黃芩苷可能是其發(fā)揮臨床治療作用的有效成分。近年來研究表明，沒食子酸還具有抗腫瘤作用[6]，在一定劑量范圍內對H2O2誘導的人神經母細胞癌細胞素SH-SYSY神經細胞損傷具有明顯的保護作用[7]，同時具有較強的體外抗氧化作用[8]；黃芩苷對人肝癌HepG2.0細胞生長具有明顯抑制作用[9]，對急性肺損傷大鼠具有保護作用[10]，上述結論與本研究結果一致，可為臨床用藥提供一定參考。

參考文獻

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[3]宋李冬，趙莉.中醫(yī)藥治療痛經臨床研究進展[J].河北中醫(yī)，2010，32（11）:1737.

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[8]謝曉艷，劉洪濤，張吉，等.沒食子酸體外抗氧化作用研究[J].重慶醫(yī)科大學學報，2011，36（3）:319.

[9]習浩，劉榮靜，麥飄予，等.黃芩苷對人肝癌細胞HepG2.0的抑瘤作用[J].廣東醫(yī)學，2013，34（10）:1493.

[10]潘永利.黃芩苷對急性肺損傷大鼠的保護作用[J].中國實驗方劑學雜志，2013，19（3）:69.