10種心血管類中藥注射劑對(duì)人細(xì)胞色素P4507種亞型的體外抑制作用Δ

劉麗雅，韓永龍，余奇，朱金輝，郭澄1，#（1.上海中醫(yī)藥大學(xué)，上海0103；.上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院藥劑科，上海 0033）

中藥注射劑是國內(nèi)獨(dú)創(chuàng)的，以中醫(yī)藥理論為指導(dǎo)，采用現(xiàn)代科技從單方或復(fù)方中藥材中提取有效物質(zhì)制成的可供注入人體內(nèi)的制劑。由于其療效獨(dú)特，在臨床上廣泛應(yīng)用。目前，獲得國家食品藥品監(jiān)督管理總局批準(zhǔn)的中藥注射劑有121種、866個(gè)批準(zhǔn)文號(hào)。這些中藥注射劑在臨床經(jīng)常與化學(xué)藥聯(lián)合使用，引起較多不良反應(yīng)。藥物相互作用（Drug drug interactions，DDI）引起的不良反應(yīng)日益受到關(guān)注，其中代謝性DDI發(fā)生率最高，約占40%[1]。細(xì)胞色素P450（CYP）被抑制或被誘導(dǎo)是導(dǎo)致藥物代謝性相互作用的主要原因，酶抑制作用約占代謝性相互作用的70%[2-3]。CYP主要存在于肝臟中，涉及藥物代謝的主要有CYP1、CYP2、CYP3家族中7種重要的亞型，包括CYP1 A2（占CYP代謝藥物的8.9%）、CYP2 B6（7.2%）、CYP2 C8（4.7%）、CYP2 C9（12.8%）、CYP2 C19（6.8%）、CYP2 D6（20%）與CYP3 A4/5（30.2%）[3]，美國食品藥物管理局在其2012版《藥物相互作用研究指南草案》中也重點(diǎn)關(guān)注了這7個(gè)亞型。

目前，研究中成藥對(duì)CYP作用的報(bào)道中，大多使用大鼠、小鼠或家兔作為體內(nèi)、外實(shí)驗(yàn)對(duì)象，由于CYP活性存在較大的種屬差異，其研究結(jié)果往往不能準(zhǔn)確反映對(duì)人的影響。筆者研究的丹紅注射液等10種心血管類中藥注射劑是臨床中使用量較大、存在多藥聯(lián)用現(xiàn)象的藥物，通過研究它們對(duì)人肝微粒體中上述7種主要的CYP亞型的體外抑制作用，可以為臨床合理用藥提供參考，避免代謝性藥物相互作用的發(fā)生。

1 材料

1.1 儀器

Agilent QQQ液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，包括G6410 B型三重串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜、G1311 A型四元輸液泵、G1322 A型脫氣機(jī)、G1367 B型自動(dòng)進(jìn)樣器、G1316 A型柱溫箱，配有電噴霧源和MassHunter軟件工作站（美國Agilent公司）；BP211 D型電子天平（德國Sartorius公司）；BR 4 i型高速冷凍離心機(jī)（法國Jouan公司）；Vortex Genie 2型渦旋混懸器（美國Vortex公司）；MDF-U32 V型超低溫冰箱（日本Sanyo公司）；Q型純水系統(tǒng)（美國Millipore公司）；DKZ-1型電熱恒溫振蕩水槽（上海一恒科技有限公司）。

1.2 藥品與試劑

丹紅注射液（DH，菏澤步長制藥有限公司，批號(hào):12091003）；紅花注射液（HH，太原華衛(wèi)藥業(yè)有限公司，批號(hào):11102701）；丹參注射液（DS，上海中西制藥有限公司，批號(hào):130307）；注射用丹參多酚酸鹽（DSDF，上海綠谷制藥有限公司，批號(hào):12120221）；燈盞細(xì)辛注射液（DZXX，云南生物谷燈盞花藥業(yè)有限公司，批號(hào):20121235）；注射用燈盞花素（DZHS，昆明龍津藥業(yè)股份有限公司，批號(hào):20120918-1）；參麥注射液（SM，正大青春寶藥業(yè)有限公司，批號(hào):1207115）；參附注射液（SF，雅安三九藥業(yè)有限公司，批號(hào):120802）；舒血寧注射液（SXN，神威藥業(yè)集團(tuán)有限公司，批號(hào):130204 A2）；疏血通注射液（SXT，牡丹江友搏藥業(yè)有限公司，批號(hào):2012042521）；對(duì)乙酰氨基酚（批號(hào):100018-200408）、雙氯芬酸（批號(hào):100334-200302）、咪達(dá)唑侖（批號(hào):171250-200401）、槲皮素（批號(hào):100081-200907）、噻氯匹定（批號(hào):100542-200301）、酮康唑（批號(hào):100294-200602）、維拉帕米（批號(hào):100223-300102）均購自中國食品藥品檢定研究院；氧化型輔酶Ⅸ（NADP）、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（G-6-PDH）、葡萄糖-6-磷酸（G-6-P）、4-羥基美芬妥英、右啡烷、非那西丁、右美沙芬、呋拉茶堿、塞替派、磺胺苯吡唑均購于美國Sigma公司；去甲阿莫地喹、阿莫地喹、s-美芬妥英均購自加拿大TRC公司；羥基安非他酮（美國Cerilliant公司）；4-羥基雙氯芬酸（美國TLC公司）；1-羥基咪達(dá)唑侖（美國IL公司）；安非他酮（日本TCI公司）；奎尼?。ㄖ袊凫`威科技有限公司）；其余無機(jī)鹽均為分析純，有機(jī)溶劑均為色譜純，水為超純水。

1.3 微粒體

混合人肝微粒體（上海瑞德肝臟疾病研究有限公司）。

2 方法

2.1 待測藥物溶液的制備[4]

10種心血管類中藥注射劑除DSDF 200mg和DZHS 50mg分別用10ml的0.9%NaCl溶解作為貯備液外，其余都以原液作為貯備液，用pH7.4的100mmol/L PBS逐步稀釋至9個(gè)不同濃度的工作液。DSDF的質(zhì)量濃度范圍為2～4000μg/ml；DZHS的質(zhì)量濃度范圍為0.5～1000μg/ml；DH、HH和DZXX的體積分?jǐn)?shù)范圍為0.001%～1.6%；DS與SXT的體積分?jǐn)?shù)范圍為0.01%～20%；SM、SF和SXN的體積分?jǐn)?shù)范圍為0.015%～30%。

2.2 體外人肝微粒體孵育體系

終體積為250μl的體外孵育體系包括混合人肝微粒體蛋白（0.25mg/ml）、MgCl2（5mmol/L）、G-6-PDH（1u/ml）、G-6-P（5mmol/L）、PBS（100mmol/L）、混合探針底物（非那西丁、安非他酮、阿莫地喹、雙氯芬酸、s-美芬妥英、右美沙芬、咪達(dá)唑侖終濃度分別為20、30、0.1、1、40、2、2 μmol/L）和不同質(zhì)量濃度的待測藥物或陽性抑制劑，在37Ⅸ水浴中預(yù)孵化5min后加入尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP+，1mmol/L）啟動(dòng)反應(yīng)，孵化10min，整個(gè)孵育體系控制有機(jī)溶劑的體積分?jǐn)?shù)在1%以內(nèi)。用25μl含內(nèi)標(biāo)維拉帕米的終止液[H2O∶CH3CN∶HCOOH＝42∶55∶3（V/V/V）][5]在冰上終止反應(yīng)，然后渦旋混合30 s后，4Ⅸ下、20000×g離心15min，取上清液20μl進(jìn)樣。生成相應(yīng)的7種代謝產(chǎn)物對(duì)乙酰氨基酚、羥基安非他酮、去阿莫地喹、4-羥基雙氯芬酸、4-羥基美芬妥英、右啡烷、1-羥基咪達(dá)唑侖，用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）定量分析。

2.3 色譜與質(zhì)譜條件[5]

2.3.1 色譜條件色譜柱:Agilent XDBC18（50mm×2.1mm，3.5μm）；流動(dòng)相A:水（0.1%甲酸），流動(dòng)相B:乙腈（0.1%甲酸），采用梯度洗脫[0→4.0min，5%→80%（B）；4.0→4.2min，80%（B）；4.2→6.0min，80%→5%（B）]；流速:0.3ml/min ；柱溫:40Ⅸ。

2.3.2 質(zhì)譜條件 離子源:ESI源；掃描方式:多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）；噴霧電壓:4kV；噴霧起壓:40psi；霧化器溫度:350Ⅸ；氣流速度:11 L/min。7個(gè)探針?biāo)幬锎x產(chǎn)物及內(nèi)標(biāo)的MRM質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 7個(gè)探針?biāo)幬锎x產(chǎn)物及內(nèi)標(biāo)的MRM質(zhì)譜參數(shù)Tab 1 Multiple reaction response monitoring spectrum parameters of 7probe substrates and internal standard

2.4 陽性抑制劑半數(shù)抑制濃度（IC50）測定

將7個(gè)不同濃度的陽性抑制劑[呋拉茶堿（0.0192～19.2μmol/L）、塞替派（0.528～528μmol/L）、槲皮素（0.015～15μmol/L）、磺胺苯吡唑（0.0075～7.5μmol/L）、噻氯匹定（0.0176～17.6μmol/L）、奎尼?。?.0008～0.75μmol/L）和酮康唑（0.0003～0.3 μmol/L）]分別與“2.2”項(xiàng)下混合底物共同孵化，對(duì)照加入等體積100mmol/L PBS代替，每個(gè)樣品平行操作3次，余下孵育處理程序同”2.2”項(xiàng)下方法，測定同”2.3”項(xiàng)下方法。使用GraphPad Prism v5.0軟件按照非線性回歸，作圖并計(jì)算IC50。

2.5 10種心血管類中藥注射劑半數(shù)抑制體積分?jǐn)?shù)/質(zhì)量濃度（IC50）的測定

取“2.1”項(xiàng)下10種心血管類中藥注射劑9個(gè)不同質(zhì)量濃度的工作液，逐個(gè)與“2.2”項(xiàng)下混合底物及體外人肝微粒體孵育體系共同孵化，對(duì)照加入等體積100mmol/L的PBS代替，每個(gè)樣品平行操作3次，余下孵育處理程序同“2.2”項(xiàng)下方法，測定同“2.3”項(xiàng)下方法。使用GraphPad Prism v5.0軟件按照非線性回歸，作圖并計(jì)算IC50。

3 結(jié)果

3.1 陽性抑制劑對(duì)CYP7個(gè)亞型活性的抑制作用

為評(píng)價(jià)方法的合理性，在測定藥物對(duì)CYP 7個(gè)亞型抑制作用的同時(shí)也測定了陽性抑制劑的抑制作用。結(jié)果表明，CYP1 A2、CYP2 B6、CYP2 C8、CYP2 C9、CYP2 C19、CYP2 D6和CYP3 A4/5的陽性抑制劑呋拉茶堿、塞替派、槲皮素、磺胺苯吡唑、噻氯匹定、奎尼丁和酮康唑?qū)ο鄳?yīng)酶型均表現(xiàn)出明顯的抑制作用。陽性抑制劑的IC50見表2。

表2 陽性抑制劑的IC50Tab 2 IC50of positive inhibitors

3.2 10種心血管類中藥注射劑對(duì)CYP7個(gè)亞型活性的抑制作用

10種心血管類中藥注射劑中DH對(duì)7種CYP均有明顯抑制作用，其中對(duì)CYP2 C8的抑制作用最強(qiáng)，其次依次是CYP1 A2、CYP3 A4/5、CYP2 B6、CYP2 D6、CYP2 C19和CYP2 C9；HH對(duì)CYP2 C8有明顯抑制作用；其余8種中藥注射劑對(duì)CYP各亞型活性無明顯抑制作用（IC50均大于日用藥量）或無抑制作用。DH對(duì)CYP7種亞型與HH對(duì)CYP2 C8的體外抑制效果見圖1；心血管類中藥注射劑IC50見表3。

4 討論

Cocktail探針?biāo)幬锓ㄖ饕糜谠u(píng)價(jià)藥物對(duì)CYP活性的影響，該方法可以使多個(gè)代謝途徑的信息綜合反映在單個(gè)實(shí)驗(yàn)過程當(dāng)中，明顯地縮短分析周期，提高分析效率，節(jié)省人力物力，更重要的是這種方法可以減少個(gè)體間差異對(duì)研究結(jié)果的影響[9]。本研究中選用的7種CYP的已知特異性抑制劑，分別與混合探針底物共同孵化，計(jì)算得到的IC50與文獻(xiàn)[6-8]報(bào)道值具有較好的一致性，表明筆者建立的Cocktail探針?biāo)幬锓梢杂糜谘芯克幬飳?duì)CYP 7種亞型的體外抑制作用。

圖1 DH對(duì)CYP7種亞型與HH對(duì)CYP2 C8的體外抑制效果A～G.DH對(duì)CYP7種亞型的體外抑制效果；H.HH對(duì)CYP2 C8的體外抑制效果Fig 1 Inhibitory effects of Danhong injection on 7 subtypes of human CYPand that of Honghua injection on CYP2 C8A～G.Inhibitory effects of Danhong injection on 7subtypes of human CYP；H.Innhibitory effects of Honghua injection on CYP2 C8

在預(yù)試驗(yàn)中，筆者采用10種心血管類中藥注射劑的日用藥量研究了對(duì)CYP各亞型的抑制作用，結(jié)果顯示不同中藥注射劑對(duì)CYP活性影響差異大，同一種中藥注射劑對(duì)7種CYP亞型活性影響也不盡相同，若選用統(tǒng)一的體積分?jǐn)?shù)/質(zhì)量濃度范圍進(jìn)行測定，將會(huì)影響IC50的計(jì)算。因此根據(jù)上述抑制作用結(jié)果，針對(duì)每種中藥注射劑篩選出不同的體積分?jǐn)?shù)/質(zhì)量濃度范圍進(jìn)行測定。文獻(xiàn)[4，10]采用在體外微粒體孵育體系中直接加入不同體積比的注射劑評(píng)估其對(duì)CYP各亞型的影響，并計(jì)算出相應(yīng)的IC50（以加入中藥注射劑原液體積占孵育體系的總體積的體積分?jǐn)?shù)表示）。筆者采用此法計(jì)算出了8種心血管類中藥注射劑對(duì)CYP 7個(gè)亞型的IC50。另外2種注射劑，DSDF和DZHS用適當(dāng)溶媒稀釋后作為注射液進(jìn)行上述測定，最后經(jīng)換算以μg/ml表示IC50。表3中的日用藥體積分?jǐn)?shù)/質(zhì)量濃度為這些心血管類中藥注射劑說明書中規(guī)定的臨床每日用藥劑量與人體中血液5 L的比值，DH對(duì)7種CYP的IC50范圍為0.09%～0.98%，均低于日用體積分?jǐn)?shù)1.6%。提示在正常劑量下，DH對(duì)CYP1 A2、CYP2 B6、CYP2 C8、CYP2 C9、CYP2 C19、CYP2 D6和CYP3 A4/5均可能有抑制作用。余小翠等[11]研究表明，DH對(duì)大鼠肝微粒體CYP1 A2活性有抑制作用，其IC50為0.54%且為混合型抑制，對(duì)CYP2 C9有弱抑制作用，對(duì)CYP2 D6、CYP2 E1、CYP3 A4活性無明顯影響。本研究中DH對(duì)CYP1 A2的IC50為0.49%，結(jié)果與上述文獻(xiàn)相近。大鼠與人共有的CYP亞型僅有CYP1 A2與CYP2 E1[12]，Turpeinen M等[13]的體外肝微粒體研究結(jié)果表明，與人CYP1 A2、CYP3 A活性相關(guān)性好的動(dòng)物模型分別為大鼠和小鼠，這可能是導(dǎo)致丹紅注射液對(duì)CYP2 C9、CYP2 D6和CYP3 A4/5結(jié)果與文獻(xiàn)[11]差異的原因，最終還需臨床試驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。

表3 心血管類中藥注射劑IC50Tab 3 IC50of cardiovascular TCM injections

研究表明，臨床近90%的化學(xué)藥物經(jīng)由CYP1 A2、CYP2 B6、CYP2 C8、CYP2 C9、CYP2 C19、CYP2 D6和CYP3 A4/5這7種CYP亞型代謝[3]，因此此類化學(xué)藥物聯(lián)合使用DH或HH時(shí)需謹(jǐn)慎，以避免產(chǎn)生代謝性藥物相互作用導(dǎo)致的藥物不良反應(yīng)。

[1]Zhang L，Reynolds KS，Zhao P，et al.Drug interactions evaluation:an integrated part of risk assessment of therapeutics[J].Toxicol Appl Pharmacol，2010，243（2）:134.

[2]Wienkers LC，Heath TG.Predicting in vivo drug interactions from in vitro drug discovery data[J].Nat Rev Drug Discov，2005，4（10）:825.

[3]Zanger UM，Schwab M.Cytochrome P450enzymes in drug metabolism:regulation of gene expression，enzyme activities，and impact of genetic variation[J].Pharacol Ther，2013，138（1）:103.

[4]韓永龍，孟祥樂，李丹，等.清開靈注射液及其主要成分黃芩苷和梔子苷對(duì)人肝微粒體CYP450酶6種亞型的體外抑制作用研究[J].中國藥學(xué)雜志，2011，46（19）:1486.

[5]De Bock L，Boussery K，Colin P，et al.Development and validation of a fast and sensitive UPLC-MS/MS method for the quantification of six probe metabolites for the in vitro determination of cytochrome P450activity[J].Talanta，2012（89）:209.

[6]Kozakai K，Yamada Y，Oshikata，et al.Reliable high-throughput method for inhibition assay of 8cytochrome P450isoforms using cocktail of probe substrates and stable isotope-labeled internal standards[J].Drug Metab Pharmacokinet，2012，27（5）:520.

[7]Otten J，Hingorani G，Hartley D，et al.An in vitro，high throughput，seven CYP cocktail inhibition assay for the evaluation of new chemical entities using LC-MS/MS[J].Drug Metab Letters，2011，5:17.

[8]李丹.五味子及其制劑與尼洛替尼的代謝性藥物相互作用研究[D].上海:上海中醫(yī)藥大學(xué)，2012.

[9]王亮，郭姣，石忠峰，等.“Cocktail”探針?biāo)幬锓ǖ难芯克悸放c應(yīng)用[J].遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，12（11）:30.

[10]樊慧蓉，和凡，劉昌孝.“Cocktail”探針?biāo)幬锓ㄓ糜谠u(píng)價(jià)細(xì)胞色素P450同工酶影響的研究進(jìn)展[J].中國藥學(xué)雜志，2006，41（14）:1045.

[11]余小翠，黃麗軍，劉高峰，等.丹紅注射液對(duì)大鼠肝微粒體5種CYP亞型酶活性的影響[J].醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2012，31（3）:277.

[12]Martignoni M，Groothuis GM，de Kanter R.Species differences between mouse，rat，dog，monkey and human CYP-mediated drug metabolism，inhibition and induction[J].Expert Opin Drug Metab Toxicol，2006，2（6）:875.

[13]Turpeinen M，Ghiciuc C，Opritoui M，et al.Predictive value of animal models for human cytochrome P450（CYP）-mediated metabolism:a comparative study in vitro[J].Xenobiotica，2007，37（12）:1367.