柚皮素β-環(huán)糊精包合物的制備及對模型大鼠脈絡(luò)膜新生血管形成的抑制作用Δ

徐新榮，于海濤，杭麗，邵雁，丁淑華，楊學文（.南京中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院眼科，南京009；.南京中醫(yī)藥大學藥學院，南京 00；.南京中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院檢驗科，南京 009）

脈絡(luò)膜新生血管（CNV）見于許多眼底疾病，如年齡相關(guān)性黃斑變性（AMD）、中心性滲出性脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜炎與高度近視引起的黃斑病變等，其中以AMD繼發(fā)性CNV最常見，已成為老年人不可逆性視功能損害的主要原因之一。

對CNV的治療藥物研發(fā)近年取得了較大進展，主要是皮質(zhì)類固醇抗炎藥和血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）拮抗藥。但是，皮質(zhì)類固醇會導致眼壓升高；VEGF拮抗藥需要反復(fù)眼內(nèi)注射，費用高，且長期生物安全性尚待進一步觀察。因此，多途徑尋找安全有效的防治CNV藥物有重要的醫(yī)學和社會意義。

柚皮素是廣泛存在于植物中的二氫黃酮類化合物。有研究顯示，柚皮素有抑制CNV形成的作用[1]，但其水溶性差，生物利用度不高。β-環(huán)糊精（β-CD）能改善藥物的溶解度和穩(wěn)定性，增強藥物生物利用度。基于此，筆者制備了柚皮素β-CD包合物，考察其理化性質(zhì)，并采用激光誘導的大鼠CNV模型，評價其對CNV形成的抑制作用，為其臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

752型紫外分光光度計（上海菁華科技儀器有限責任公司）；X′TRA型X射線衍射儀（瑞士ARL公司）；IR-100型紅外分光光度計（美國Thermo Nicolet公司）；BS124 S型電子分析天平（德國Sartorius公司）；THZ-C型恒溫振蕩器（太倉市實驗設(shè)備廠）；ZF-6050型真空干燥箱（上海精宏實驗設(shè)備有限公司）；OTHWS-2型恒溫磁力攪拌器（上海志威電器有限公司）；BX51型熒光顯微鏡（日本Olympus公司）；Novus Varia型氪激光機（美國Lumenis公司）。

1.2 試劑

柚皮素（批號:67604-48-2，純度:＞98%）、β-CD（批號:7585-39-9，純度:98%）購自北京百靈威科技有限公司；熒光素異硫氰酸酯葡聚糖（FITC-D，美國Sigma-Aldrich公司，分子質(zhì)量:2×106）；其余試劑均為分析純。

1.3 動物

BN大鼠15只，♂，體質(zhì)量150～180 g，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供[實驗動物使用許可證號:SCXK（京）2006-009]。

2 方法

2.1 供試品的制備

2.1.1 柚皮素β-CD包合物的制備 按摩爾比1∶1準確稱取柚皮素與β-CD，先將柚皮素用少量乙醇溶解，然后在攪拌條件下緩慢加入β-CD飽和水溶液均勻混合，于60Ⅸ下攪拌30min，停止加熱并繼續(xù)攪拌5 h，自然降溫，4Ⅸ冷藏過夜，濾過，濾液經(jīng)冷凍干燥機干燥24h，得柚皮素β-CD包合物。

2.1.2 柚皮素β-CD物理混合物的制備 按摩爾比1∶1準確稱取柚皮素、β-CD，將稱好的柚皮素和β-CD置于玻璃研缽中研磨均勻得柚皮素β-CD物理混合物。

2.2 柚皮素β-CD包合物物相表征的測定

2.2.1 紅外光譜分析 稱取供試品1.5mg和KBr 200mg，在紅外燈下干燥，充分研磨后壓片，掃描范圍400～4000 cm－1。

2.2.2 X-射線衍射分析 測試條件:Cu靶；儀器溫度:50Ⅸ；電壓:40 kV；電流:100 mA；掃描速率:5°/min；掃描角度:3～50°。

2.3 柚皮素β-CD包合物含量與溶解度的測定

2.3.1 標準曲線的制備 稱取柚皮素16.3mg，置100ml量瓶中，用乙醇溶解并定容至刻度，分別量取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5ml，置50ml量瓶中，乙醇定容至刻度，搖勻，貯藏，備用。測定在288nm波長處的吸光度（A）。以柚皮素質(zhì)量濃度（c）為橫坐標，A為縱坐標，進行線性回歸，得回歸方程為A＝0.0577 c+0.06274（r＝0.9994）。結(jié)果表明，槲皮素質(zhì)量濃度在1.63～11.41mg/L范圍內(nèi)與A呈良好線性關(guān)系。

2.3.2 含量的測定 稱取柚皮素β-CD包合物適量，置100ml量瓶中，用70%乙醇超聲溶解并稀釋至刻度。吸取上述溶液1ml，置10ml量瓶中，70%乙醇定容至刻度，于288nm波長處測定A，代入回歸方程，計算c，求算柚皮素β-CD包合物中柚皮素的含量。

2.3.3 溶解度的測定 稱取柚皮素β-CD包合物適量，于水溶液中使成過飽和溶液，于37Ⅸ、100次/min恒溫空氣浴振蕩48 h，吸取上清液，用0.8 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，適當稀釋后于288nm波長處測定A，代入回歸方程，求算柚皮素β-CD包合物中柚皮素的溶解度。柚皮素溶解度測定同上。

2.4 柚皮素β-CD包合物對模型大鼠的保護作用

2.4.1 模型的復(fù)制 參考文獻[2]方法。im氯胺酮（50mg/kg）麻醉大鼠，用0.5%托吡卡胺和新福林混合散瞳劑散瞳，采用氪黃激光（波長568nm，參數(shù):光斑直徑為100μm，曝光時間為0.1s，功率為150～200mW），在120D專用前置鏡下距視盤2～4盤徑，圍繞視盤在視網(wǎng)膜大血管間光凝8個點，看到Bruch膜被擊破后產(chǎn)生小氣泡為合格光凝點，有視網(wǎng)膜、脈絡(luò)膜或玻璃體出血者剔除。

2.4.2 分組與給藥 15只大鼠均分為3組，即溶媒對照（等容溶媒）組、柚皮素（20mg/kg）組與柚皮素β-CD包合物（97.4mg/kg）組。視網(wǎng)膜光凝后開始ip給藥，每天1次，連續(xù)4周。

2.4.3 脈絡(luò)膜鋪片法測量CNV面積 末次給藥后iv FITC-D，1 h后摘取眼球于40 g/L多聚甲醛溶液中固定1 h，顯微鏡下沿赤道部打開眼球，去除前節(jié)，揭除視網(wǎng)膜神經(jīng)層，獲得視網(wǎng)膜色素上皮-脈絡(luò)膜-鞏膜復(fù)合體標本，以視神經(jīng)為中心，放射狀剪開標本，將視網(wǎng)膜色素上皮細胞（RPE）面向下置于蓋玻片上，封片、烤片，標本置于熒光顯微鏡下觀察，拍片，用Image J圖像分析軟件進行分析。

2.5 統(tǒng)計學方法

3 結(jié)果

3.1 紅外光譜分析結(jié)果

顯示柚皮素在1790～1540、1530～1200、960～750 cm－1有很強的吸收信號，柚皮素和β-CD包合后，受β-CD影響明顯產(chǎn)生了紅移。柚皮素β-CD物理混合物光譜可以明顯看出僅是柚皮素和β-CD二者的疊加。紅外光譜見圖1。

圖1 紅外光譜圖A.β-CD；B.柚皮素；C.柚皮素β-CD物理混合物；D.柚皮素β-CD包合物Fig 1 FTIR spectrogramsA.β-CD；B.naringenin；C.ncringenin-β-CD physical mixture；D.naringenin-β-CD

3.2 X-射線衍射分析結(jié)果

可見，柚皮素在 10.7、11.4、15.6、17.3、15.2、20.6、22.3、23.7、25.7、27.8°有一系列強烈衍射峰，這表明了它的晶體性質(zhì)，而β-CD則表現(xiàn)為幾個很寬的峰，說明β-CD的無定形性質(zhì)。柚皮素β-CD物理混合物的衍射圖則為柚皮素和β-CD衍射峰的疊加，沒有出現(xiàn)新的峰，但峰的強度有所變化。柚皮素β-CD包合物只有2個很寬的β-CD衍射峰，柚皮素的特征峰消失，說明柚皮素被β-CD包合。X-射線衍射圖見圖2。

圖2 X-射線衍射圖A.柚皮素；B.β-CD；C.柚皮素β-CD物理混合物；D.柚皮素β-CD包合物Fig 2 X-ray diffraction spectraA.naringenin；B.β-CD；C.naringenin-β-CD physical mixture；D.naringenin-β-CD

3.3 溶解度與含量測定結(jié)果

柚皮素β-CD包合物中柚皮素包合率為81.06%，質(zhì)量分數(shù)為20.53%；柚皮素在水中的溶解度為71.85μg/ml，包合后柚皮素的溶解度為846.28μg/ml，可見β-CD能顯著提高柚皮素在水中的溶解度。

3.4 柚皮素β-CD包合物對模型大鼠CNV面積的影響

與溶媒對照[（34.73±1.53）×103μm2]組比較，柚皮素[（20.91±1.47）×103μm2]組與柚皮素β-CD包合物[（13.20±1.38）×103μm2]組大鼠CNV面積減少，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01或P＜0.05）；與柚皮素組比較，柚皮素β-CD包合物組大鼠CNV面積減少，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。大鼠脈絡(luò)膜鋪片見圖3。

圖3 大鼠脈絡(luò)膜鋪片A.溶媒對照組；B.柚皮素組；C.柚皮素β-CD包合物組Fig 3 Representative fluorescent photos of choroidal in ratsA.solvent control group；B.naringenin group；C.naringenin-β-CD

4 討論

近年來，中藥抑制眼部新生血管形成為眼科藥物研究的熱點。許多黃酮類藥物有較強CNV形成抑制作用，如柚皮素、芹黃素、漢防己甲素[3-4]等。

柚皮素廣泛存在于檸檬、葡萄汁、橘子、枳殼、胡柚皮中，具有廣泛的生物活性，如抗動脈粥樣硬化、抗炎、抗氧化、抗癌、祛痰、降脂等。筆者前期研究顯示，柚皮素能改善脈絡(luò)膜血流，抑制環(huán)氧合酶（COX）-2、誘導型一氧化氮合酶（iNOS）的表達，從而下調(diào)VEGF表達，抑制CNV形成[5]。但是，柚皮素的水溶性差，生物利用度低，尚不能用于臨床。CD分子有一個含有富電性疏水空腔和親水性外壁的特殊結(jié)構(gòu)[6-8]，針對許多藥物分子的水溶性和穩(wěn)定性缺陷，CD常用作改善藥物分子缺點的載體。戴玉杰等[9]用羥丙基（HP）-β-CD對對乙酰氨基苯乙酸進行包合，發(fā)現(xiàn)HP-β-CD能夠明顯增大對乙酰氨基苯乙酸的溶解度；張艷斌等[10]制備P-糖蛋白底物鹽酸小檗堿HP-β-CD包合物，采用單向腸灌流法考察CD包合作用對鹽酸小檗堿在大鼠體內(nèi)腸吸收的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)鹽酸小檗堿被HP-β-CD包合后，在小腸中的吸收速率常數(shù)及有效滲透系數(shù)明顯增大，分別為原來的5.31、5.05倍。Shulman M等[11]研究結(jié)果顯示，柚皮素用HP-β-CD包合后，溶解度為原來的400倍，跨Caco-2細胞轉(zhuǎn)運能力為原來的11倍，在大鼠體內(nèi)生物利用度檢測結(jié)果中AUC為原來的7.4倍，cmax為原來的14.6倍。目前，CD包合物的研究主要集中在制備工藝、理化性質(zhì)和生物利用度方面，用于疾病研究的較少。筆者制備的柚皮素β-CD包合物，采用紅外光譜和X-射線衍射法對包合物進行鑒定，證明柚皮素和β-CD形成了穩(wěn)定的包合物；溶解度檢測結(jié)果顯示β-CD包合后柚皮素在水中的溶解度為原來的11.8倍，這與文獻[1]報道比偏低，可能與采用的包合物為β-CD，其水溶性較HP-β-CD低有關(guān)。同時，通過大鼠激光誘發(fā)CNV模型體內(nèi)研究證實，柚皮素β-CD包合物抑制CNV形成的作用強于柚皮素，提示柚皮素β-CD包合后生物活性得到明顯提高。

目前，已經(jīng)進入各國藥典的CD及其衍生物有α-CD、β-CD、γ-CD、HP-β-CD、二甲基（DM）β-CD、三氧甲基（TM）β-CD和磺基丁基醚（SEB）β-CD等7種，CD包合的藥物已經(jīng)上市的有30多種，劑型包括片劑、注射劑、膠囊劑、栓劑和滴眼劑等。下一步筆者將采用CD衍生物進行柚皮素包合，篩選出生物利用度更高的包合物進行臨床前期研究，為開發(fā)出有臨床應(yīng)用價值的CNV防治藥物打下基礎(chǔ)。

[1]Ji J，Xu XR，Chiou GC.Effects of naringenin on ocular blood flow and choroidal neovascularization in experimental animals[J].Int J Ophthalmol，2009，2（4）:320.

[2]Singh SR，Grossniklaus HE，Kang SJ，et al.Intravenous transferrin，RGD peptide and dual-targeted nanoparticles enhance anti-VEGF intraceptor gene delivery to laser-induced CNV[J].Gene Ther，2009，16（5）:645.

[3]Zou Y，Chiou GC.Apigenin inhibits laserinduced choroidal neovascularization and regulates endothelial cell function[J].J Ocul Pharmacol Ther，2006，22（1）:425.

[4]Zou Y，Jiang W，Chiou GC.Effect of tetramethylpyrazine on rat experimental choroidal neovascularization In Vivo and endothelial cell cultures in vitro[J].Curr Eye Res，2007，32（1）:71.

[5]吉潔，徐新榮.柚皮素對激光誘導的大鼠脈絡(luò)膜新生血管的抑制作用[J].中華眼底病雜志，2010，26（1）:79.

[6]Wenz G.Cyclodextrins as building blocks for supramolec-ular structures and functional units[J].Angew Chem Int Ed Eng，1994（33）:803.

[7]Harata K.Structural aspects of stereodifferentiation in the solid state[J].Chem Rev，1998，98（5）:1803.

[8]Connors KA.The stability of cyclodextrin complexes in solution[J].Chem Rev，1997，97（5）:1325.

[9]戴玉杰，張雯雯，朱凌云.經(jīng)丙基-βCD對阿克他利的包合作用研究閉[J].中國新藥雜志，2008，17（19）:1695.

[10]張艷斌，崔元璐.CD包合作用對在體大鼠腸道P-糖蛋白藥泵的影響[J].中國藥理學通報，2008，24（10）:1318.

[11]Shulman M，Cohen M，Soto-Gutierrez A，et al.Enhancement of naringenin bioavailability by complexation with hydroxypropoyl-β-cyclodextrin[J].PLoS One，2011，6（4）:1.