白芍總苷對(duì)糖尿病大鼠腎組織Toll樣受體信號(hào)通路調(diào)節(jié)的研究

章超群，武曉旭，吳永貴，徐興欣，張 煒，王 坤

（安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院腎內(nèi)科，安徽合肥 230022）

新近研究表明炎性參與糖尿病腎病（diabetic nephropathy，DN）發(fā)生、發(fā)展［1］。Toll樣受體（Tolllike-receptors，TLR）是一個(gè)主要分布于炎癥細(xì)胞的識(shí)別病原分子的受體超家族，其中TLR2與TLR4可以通過(guò)髓分化因子88（myeloid differentiation factor88，MyD88）依賴和MyD88非依賴途徑，激活NF-κB，介導(dǎo)下游信號(hào)傳導(dǎo)，引起前炎癥因子TNF-α、IL-1β表達(dá)增加，后者再進(jìn)一步激活NF-κB，繼而誘發(fā)炎癥信號(hào)不斷放大［2］。多個(gè)研究表明TLRs家族的成員可能參與介導(dǎo)DN的發(fā)生、發(fā)展。白芍總苷（total glucosides of paeony，TGP）是從白芍干燥根中提取的混合物，主要成分為芍藥苷、羥基芍藥苷、芍藥花苷、芍藥內(nèi)酯苷、苯甲酰芍藥苷等，對(duì)多種炎癥性病理如大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎、角叉菜膠誘導(dǎo)的大鼠足爪腫脹和環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的細(xì)胞和體液免疫增高或降低等具有明顯的抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用［3］。我們以前的研究表明TGP對(duì)DN有明顯保護(hù)作用，并與抑制腎組織NF-κB激活，抑制 TNF-α、IL-1β表達(dá)有關(guān)［4－5］，但TGP對(duì)DN腎內(nèi)TLR信號(hào)通路調(diào)節(jié)作用尚未闡明，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步觀察TGP對(duì)糖尿病大鼠腎組織TLR通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響，為TGP用于DN臨床干預(yù)提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 昆明種Munich-Wistar大鼠50只，由安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，體質(zhì)量180～200 g，于（22±2）℃、（55±5）%相對(duì)濕度、12 h～12 h光照周期環(huán)境中適應(yīng)飼養(yǎng)1周后實(shí)驗(yàn)。

1.2 藥品與試劑 TGP由安徽醫(yī)科大學(xué)臨床藥理研究所魏偉教授惠贈(zèng)，使用前溶于1%的羧甲基纖維素鈉溶液中；鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）系Sigma公司生產(chǎn)，用前于 0.01 mmol·L－1枸櫞酸緩沖液中溶解，pH 4.5；尿白蛋白測(cè)定試劑盒購(gòu)自法國(guó)SPI公司；TLR2、TLR4、MyD88、NF-κB多克隆抗體和ED-1單克隆抗體購(gòu)自美國(guó) Santa Cruz公司；p-IRAK1和p-IRF3多克隆抗體購(gòu)自北京博奧森公司；辣根酶標(biāo)記山羊抗兔／小鼠IgG購(gòu)自武漢博士德公司，硝酸纖維膜（NC）購(gòu)自美國(guó)Amersham公司；ECL發(fā)光試劑購(gòu)自Pierce公司。TLR2、TLR4、MyD88及GAPDH引物及探針由上海生工公司合成；M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑購(gòu)自美國(guó)Promega公司；d-NTP、隨機(jī)引物購(gòu)自上海生工公司；Tag酶及MgCl2購(gòu)自美國(guó)Roche公司；TRIzol試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司。

1.3 建立糖尿病大鼠模型 實(shí)驗(yàn)大鼠腹腔1次性注射STZ 65 mg·kg－1，48～72 h后于尾靜脈采血，應(yīng)用血糖儀測(cè)定全血血糖，血糖在16.7 mmol·L－1以上者確定為糖尿病模型，正常組僅注射等量枸櫞酸緩沖液。

1.4 動(dòng)物分組及處理 大鼠隨機(jī)分為：正常組（Normal，n＝10）、糖尿病模型組（Diabetic model，n＝10）、糖尿?。玊GP組（Control diabetic＋TGP，n＝30）。其中TGP組再隨機(jī)分為3組，每組10只，按50、100、200 mg·kg－1·d－1灌胃給藥，正常組與糖尿病模型組給予等量溶媒。實(shí)驗(yàn)期間不應(yīng)用胰島素，觀察8周。

1.5 標(biāo)本收集 大鼠處死前1 d放入代謝籠中準(zhǔn)確收集24 h尿液，離心后分裝，－80℃保存，待測(cè)尿白蛋白含量。然后在戊巴比妥腹腔注射麻醉下行右側(cè)頸總動(dòng)脈插管收集血標(biāo)本，4℃離心取血漿保存于－20℃待測(cè)血糖水平。然后，通過(guò)右側(cè)頸總動(dòng)脈插管注入4℃預(yù)冷的生理鹽水反復(fù)灌洗腎臟，至整個(gè)腎臟顏色變蒼白后游離，置于冰上，取8 mm3大小腎組織置于4%多聚甲醛溶液中固定，石蠟包埋，制成厚度為2μm經(jīng)多聚賴氨酸處理的石蠟切片，進(jìn)行免疫組化研究，剩余組織迅速放入－80℃冰箱待測(cè)。

1．6 尿白蛋白排泄率（AER）的測(cè)定 采用ELISA法測(cè)定尿白蛋白含量，AER為尿白蛋白含量與24 h尿量乘積。

1.7 免疫組織化學(xué) 石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，微波熱修復(fù)抗原，3%H2O2封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，山羊血清封閉非特異性抗原，分別滴加兔抗大鼠TLR2多克隆抗體（1∶75）、兔抗大鼠TLR4多克隆抗體（1∶400）、小鼠抗大鼠 ED-1單克隆抗體（1∶100），4℃孵育過(guò)夜，滴加聚合物增強(qiáng)劑及辣根酶標(biāo)記山羊抗兔／小鼠IgG多聚體，DAB顯色，陰性正常采用PBS代替一抗。每張切片在高倍鏡視野（×400）下隨機(jī)選擇10個(gè)腎小球和10個(gè)腎小管－間質(zhì)區(qū)，使用Image-ProPlus6.0圖像分析軟件計(jì)數(shù)每個(gè)腎小球及腎小管－間質(zhì)區(qū)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)及陽(yáng)性%。

1．8 Western blot 將取出的100 mg腎組織放置于冰上，并用冷生理鹽水（含0.1%蛋白酶抑制劑）沖洗，加入適量裂解液（含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑）冰上裂解后超聲勻漿，4℃離心30 min取上清液測(cè)蛋白濃度。取30 mg蛋白煮沸5 min后，經(jīng)6%～15%SDS-PAGE電泳，電轉(zhuǎn)移至NC膜上，在5%脫脂奶粉-PBST溶液4℃封閉過(guò)夜，洗膜后加入免抗大鼠 TLR2（1∶200）；TLR4（1∶200）；MyD88（1∶500）；p-IRAK1（1∶100）；p-IRF3（1∶100）；NF-κB p65（1∶100）和 β-actin（1∶500）4℃過(guò)夜，洗膜后再用 HRP標(biāo)記的二抗（1∶2 000）雜交，37℃，1 h。洗膜后在暗室中加ECL發(fā)光試劑，X線膠片曝光1～2 min后顯影、定影。雜交信號(hào)在圖像分析系統(tǒng)中進(jìn)行光密度掃描。應(yīng)用管家基因β-actin作為蛋白上樣量正常，其余組與其相比得到相對(duì)量，取均值。

1．9 實(shí)時(shí)定量PCR TRIzol法進(jìn)行組織總RNA提取，核酸蛋白紫外分析儀檢測(cè)RNA質(zhì)量和濃度，要求A260／A280在1.8～2.0，并調(diào)整RNA濃度至1 mg·L－1。TLR2引物序列：上游 5′-AAACTGTGTTCGTGCTTTCTGA-3′，下 游 5′-CTTTCTTCTCAATGGGTTCCAG-3′；TLR4引物序列：上游，5′-GAATGAGGACTGGGTGAGAAAC-3′，下游 5′-ACCAACGG CTCTGGATAAAGT-3′；MyD88引物序列：上游 5′-ATACGCAACCAGCAGAAACAG-3′，下 游 5′-TATCATTGGGGCAGTAGCAGA-3′；GAPDH引物序列：上游 5′-CCACCCATGGCAAATTCC-3′，下游 5′-TGGGATTTCCATTGATGACAAG-3′。采 用 SYBR Green PCR試劑盒進(jìn)行PCR，終體積25μl。于AB I 7000 Real Time PCR擴(kuò)增儀進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄及PCR反應(yīng)，每個(gè)樣本均設(shè)3個(gè)復(fù)孔，取均值。獲得平均Ct值，按照2－ΔΔCt計(jì)算目的基因表達(dá)值。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，正態(tài)分布資料的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用ˉx±s表示，AER為非正態(tài)分布資料，采用對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換后，用幾何均數(shù)×／÷耐受因子表示。組間比較采用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠一般指標(biāo)的變化 糖尿病模型組大鼠表現(xiàn)為血糖升高、體重下降、相對(duì)腎重增加，TGP組不能抑制大鼠血糖升高與體重下降。TGP組大鼠相對(duì)腎重與糖尿病模型組相比有所下降，但差異無(wú)顯著性。糖尿病模型組大鼠AER明顯高于正常組（P＜0.01），TGP組大鼠AER水平明顯低于糖尿病模型組（P＜0.05，0.01），見 Tab 1。

2．2 各組大鼠腎組織 TLR2、TLR4和ED-1表達(dá)的變化 免疫組化顯示糖尿病模型組大鼠腎小管－間質(zhì)TLR2蛋白表達(dá)明顯高于正常組（P＜0.01），TGP給藥組（50、100、200 mg·kg－1·d－1）腎小管 －間質(zhì)TLR2蛋白表達(dá)明顯低于糖尿病模型組（P＜0.01），見Fig 1，Tab 2；糖尿病模型組大鼠腎小球與腎小管－間質(zhì)TLR4蛋白表達(dá)明顯高于正常組（P＜0.01），TGP給藥組（50、100、200 mg·kg－1·d－1）腎小球與腎小管－間質(zhì)TLR4蛋白表達(dá)明顯低于糖尿病模型組（P＜0.05，0.01），見 Fig 2，Tab 2；糖尿病模型組大鼠腎小球與腎小管－間質(zhì)ED-1陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯高于正常組（P＜0.01），TGP給藥組（50、100、200 mg·kg－1·d－1）腎小球與腎小管 －間質(zhì)ED-1陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯低于糖尿病模型組（P＜0.05，P＜0.01），見 Fig 3，Tab 3。

2．3 各組大鼠腎組織 TLR2、TLR4、MyD88、p-IRAK1，p-IRF3與 NF-κB p65蛋白表達(dá)變化 Western blot條帶光密度分析顯示糖尿病模型腎組織TLR2、TLR4、MyD88、p-IRAK1、p-IRF3與 NF-κB p65蛋白表達(dá)明顯高于正常組（P＜0.01），TGP 50、100、200 mg·kg－1給藥8周腎組織 TLR2、TLR4、MyD88、p-IRAK1、p-IRF3與NF-κB p65蛋白表達(dá)明顯低于糖尿病組（P＜0.05，P＜0.01），見 Fig 4a、4b，F(xiàn)ig 5。

Tab 1 General and metabolic parameters in five groups of rats（ˉx±s，n＝10）

Fig 1 Immunostaining of TLR2 in the kidneys（×400）

Tab 2 Semiquantitative assessment of TLR2 and TLR4 by immunohistochemistry staining in five groups of rats（ˉx±s）

Fig 2 Immunostaining of TLR4 in the kidneys（×400）

Fig 3 Immunostaining of ED-1 in the kidneys（×400）

Fig 4a Expression of TLR2，TLR4，MyD88，p-IRAK1 and p-IRF3 determined by Western blot analysis in the kidney

Fig 4b Densitometric analysis of TLR2，TLR4，MyD88，p-IRAK1 and p-IRF3 determined by Western blot analysis in the kidney（ˉx±s，n＝10）

Fig 5 Densitometric analysis of NF-κB determined by Western blot analysis in the kidney（ˉx±s，n＝10）

Tab 3 Semiquantitative assessment of ED-1immunohistochemistry staining in five groups of rats（ˉx±s）

2．4 各組大鼠腎組織 TLR2，TLR4和 MyD88 mRNA表達(dá)變化 實(shí)時(shí)定量PCR分析顯示糖尿病模型腎組織TLR2、TLR4和MyD88 mRNA表達(dá)明顯高于正常組（P＜0.01）。TGP 50、100、200 mg·kg－1給藥8周腎組織 TLR2、TLR4和 MyD88 mRNA表達(dá)明顯低于糖尿病模型組（P＜0.05，P＜0.01），見Fig 6。

3 討論

Toll樣受體（TLR）是一類病原分子識(shí)別受體，共有11個(gè)成員［6－7］，屬于 I型跨膜蛋白，其胞外區(qū)結(jié)構(gòu)有富含亮氨酸的重復(fù)序列，負(fù)責(zé)識(shí)別不同的病原分子，胞內(nèi)區(qū)與IL-1受體的胞內(nèi)區(qū)相似，負(fù)責(zé)受體活化后的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)［8］。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，TLR是參與免疫炎癥反應(yīng)的一個(gè)關(guān)鍵因素，且認(rèn)為TLR是介導(dǎo)免疫和炎癥反應(yīng)的主體［9］。TLR2和TLR4受體是發(fā)現(xiàn)最早的TLR亞型，其在免疫炎癥性疾病中的作用也越來(lái)越多地引起關(guān)注。TLR2和TLR4能特異性地識(shí)別PAMP，通過(guò)跨膜結(jié)構(gòu)將病原相關(guān)分子刺激信號(hào)導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)，啟動(dòng)包括MyD88依賴性及非依賴性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，使轉(zhuǎn)錄因子NF-κB和AP-1活化。NF-κB是存在于細(xì)胞質(zhì)中的一種快反應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子，屬 NF-κB／Bel家族的一員，由 p50和p65組成的異源二聚體。當(dāng)細(xì)胞受到氧化應(yīng)激或者細(xì)胞因子等作用的情況下，NF-κB抑制蛋白發(fā)生磷酸化和降解，并與NF-κB解離，解離后的NF-κB轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核與其調(diào)控的靶DNA上的特異位點(diǎn)結(jié)合，激活其靶基因的轉(zhuǎn)錄［1］。激活的NF-κB可誘導(dǎo)免疫細(xì)胞的多種炎癥相關(guān)基因表達(dá)［10］，進(jìn)而參與免疫炎癥反應(yīng)調(diào)控。

Fig 6 Expression of TLR2，TLR4 and determined by Real-time PCR in the kidney（ˉx±s，n＝10）

DN是一種進(jìn)行性發(fā)展的疾病，炎癥機(jī)制是DN發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵因素，TLR信號(hào)通路在糖尿病及其相關(guān)并發(fā)癥的發(fā)生、發(fā)展中的作用已得到肯定，已有實(shí)驗(yàn)證明TLR2和TLR4在糖尿病腎組織中表達(dá)增加［11］。DN大鼠腎組織 TLR2及其內(nèi)源性配體（HSP70和HMGB1）的表達(dá)增加，并與MyD88和MCP-1表達(dá)呈正相關(guān)［12］。李貞瓊等［13］研究初步證實(shí)了TLR4參與DN腎小球硬化的發(fā)生和發(fā)展，腎小球中TLR4表達(dá)增加，一方面激活免疫細(xì)胞和腎臟實(shí)質(zhì)細(xì)胞，分泌大量炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子，促進(jìn)腎小球硬化，另一方面經(jīng)由連接蛋白MyD88依賴性或非依賴性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑誘導(dǎo)NF-κB活性增加，NF-κB被激活后除調(diào)節(jié)炎性因子的基因轉(zhuǎn)錄外還調(diào)節(jié)多種纖維相關(guān)因子的基因轉(zhuǎn)錄，同時(shí)NF-κB本身也可導(dǎo)致成纖維細(xì)胞增生、分化，促進(jìn)腎小球硬化的發(fā)生及發(fā)展，抑制TLR信號(hào)通路激活在防治DN病程進(jìn)展中具有重要的意義。

現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)TGP可以有效抑制巨噬細(xì)胞分泌TNF-α、IL-1β、IL-2等多種炎性介質(zhì)，同時(shí)可促進(jìn)特異性T調(diào)節(jié)細(xì)胞和非特異性T調(diào)節(jié)細(xì)胞的誘導(dǎo)，這可能是TGP發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用的基礎(chǔ)，但是TGP抗炎作用的轉(zhuǎn)錄因子水平的機(jī)制至今仍不十分清楚。在臨床與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中已證實(shí)TGP治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、免疫性肝損害、系統(tǒng)性紅斑狼瘡及系膜增生型腎炎療效確切，無(wú)明顯毒副作用。我們的實(shí)驗(yàn)研究［14］表明，TGP可通過(guò)恢復(fù)腎小球Nephrin表達(dá)而明顯減輕糖尿病大鼠尿白蛋白排泄，同時(shí)抑制腎組織細(xì)胞外基質(zhì)蛋白Ⅳ型膠原的產(chǎn)生，對(duì)糖尿病大鼠腎小管－間質(zhì)損傷有明顯的保護(hù)作用，而且，我們前期研究表明，TGP可抑制糖尿病腎組織TNF-α、IL-1及 ICAM-l的高表達(dá)［4－5］。

TGP對(duì)DN腎內(nèi)TLR信號(hào)通路的調(diào)節(jié)作用尚未闡明，進(jìn)一步研究TGP對(duì)DN的作用機(jī)制可為TGP應(yīng)用于DN臨床干預(yù)提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示正常組大鼠中 TLR2、TLR4、MyD88、p-IRAK1、p-IRF3和NF-κB p65表達(dá)呈現(xiàn)弱表達(dá)，而糖尿病組模型腎組織中 TLR2、TLR4、MyD88、p-IRAK1、p-IRF3和NF-κB p65表達(dá)明顯上調(diào)，AER明顯高于正常組，提示TLR信號(hào)通路的表達(dá)上調(diào)，與腎組織損傷加重有關(guān)，參與了DN的進(jìn)展。糖尿病中存在高糖、血液動(dòng)力學(xué)障礙等均可損傷腎臟固有細(xì)胞，細(xì)胞受損后TLR信號(hào)通路表達(dá)上調(diào)，同時(shí)促進(jìn)白細(xì)胞濾出到損傷部位并活化?；罨难装Y細(xì)胞除本身可表達(dá)TLR，還可以釋放大量的炎癥介質(zhì)，從而TLR信號(hào)通路介導(dǎo)的獲得性免疫反應(yīng)被觸發(fā)、炎癥細(xì)胞因子及效應(yīng)細(xì)胞分子大量產(chǎn)生，導(dǎo)致腎臟炎癥反應(yīng)，進(jìn)一步證實(shí)了炎癥反應(yīng)參與了DN的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程。而 TGP治療組腎組織中 TLR2、TLR4、MyD88、p-IRAK1、p-IRF3和 NF-κB p65表達(dá)明顯下調(diào)，AER改變明顯有所減輕，提示TGP對(duì)DN的保護(hù)作用與抑制TLR信號(hào)通路相關(guān)，其可能通過(guò)阻斷了TLR信號(hào)通路介導(dǎo)的多種炎癥與細(xì)胞因子形成，從而減輕腎臟炎癥損害，進(jìn)一步減輕腎臟損傷。本實(shí)驗(yàn)同樣發(fā)現(xiàn)糖尿病組大鼠腎組織中巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)明顯高于正常組，經(jīng)TGP干預(yù)后，與糖尿病模型組比較，腎組織中巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減少。但TGP作用于TLR炎性信號(hào)通路的具體機(jī)制尚不明確，可在今后的體內(nèi)、體外研究中進(jìn)一步闡明。

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