ABCA1、ACAT1 DNA甲基化在Hcy致THP-1單核源性泡沫細(xì)胞膽固醇流出中作用研究

楊安寧，王 磊，周龍霞，趙 麗，王艷華，蔡 欣，曹成建，楊 程，陳久凱，馬文斌，姜怡鄧

（寧夏醫(yī)科大學(xué)1.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院、2.檢驗(yàn)學(xué)院，寧夏銀川 750004）

動(dòng)脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是以單核源性巨噬細(xì)胞大量吞噬脂質(zhì)并堆積在血管內(nèi)膜下形成泡沫細(xì)胞為特征的慢性疾?。?］。腺苷三磷酸結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體 A1（ATP-binding cassette transporter A1，ABCA1）和酰基輔酶A膽固醇?；D(zhuǎn)移酶1（acylcoenzyme A：cholesterol acyltransferase-1，ACAT1）在此過程中扮演了重要角色。ABCA1介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)磷脂和游離膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)至載脂蛋白A-1，促進(jìn)高密度脂蛋白（high density lipoprotein，HDL）生成，啟動(dòng)膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)，在機(jī)體清除脂質(zhì)過程中發(fā)揮重要作用［2］。ACAT1是一種催化膽固醇和脂肪酰輔酶A合成膽固醇酯的酶，其可以降低游離膽固醇對(duì)細(xì)胞的毒性作用［3］。DNA甲基化作為表觀遺傳學(xué)的重要調(diào)控方式，在維持正常細(xì)胞功能、遺傳印記、胚胎發(fā)育、腫瘤形成以及 AS發(fā)生中起重要作用［4－5］。循證醫(yī)學(xué)證據(jù)表明，同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy）是AS的重要獨(dú)立危險(xiǎn)因子，在體內(nèi)，Hcy可能通過甲硫氨酸循環(huán)影響基因甲基化水平參與疾病發(fā)生［6］。因此，本文從DNA甲基化修飾角度探討ABCA1和ACAT1在Hcy致THP-1單核源性泡沫細(xì)胞膽固醇流出中的作用及可能機(jī)制，為進(jìn)一步認(rèn)識(shí)泡沫細(xì)胞脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)平衡提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器和試劑 倒置相差顯微鏡（Olympus公司，日本）；超凈工作臺(tái)（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司，中國(guó)）；電泳儀（Bio-Rad，美國(guó)）；CO2培養(yǎng)箱（Heraeus，德國(guó)）；Epoch全波段酶標(biāo)儀（BioTek，美國(guó)）；BS110S型精密天平（Sartorius，德國(guó)）；PCR儀（Bio-Rad，美國(guó)）；HyClone RPMI 1640培養(yǎng)基（Thermo）；胎牛血清（杭州四季青生物工程材料研究所）；Hcy（Sigma）；總膽固醇（TC）試劑盒和游離膽固醇（FC）試劑盒及油紅O染色試劑盒（南京建成生物工程研究所）；青、鏈霉素（碧云天生物技術(shù)研究所）；佛波酯（PMA，Promega）；基因組DNA提取試劑盒（北京天根生物技術(shù)有限公司）；DNA甲基化修飾試劑盒、DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶（DNMTs）活性分析試劑盒（Epigentek，美國(guó)）；引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1．2 THP-1單核源性泡沫細(xì)胞培養(yǎng)與分組 復(fù)蘇THP-1單核細(xì)胞，加入含10%胎牛血清，1%雙抗的RPMI 1640培養(yǎng)基，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱傳代培養(yǎng)，以4×109·L－1個(gè)細(xì)胞接種于25 cm2培養(yǎng)瓶，加入終濃度為100 nmol·L－1PMA的低血清培養(yǎng)基，37℃、5%CO2培養(yǎng)48 h，觀察細(xì)胞貼壁狀態(tài)，確定THP-1單核細(xì)胞已分化為巨噬細(xì)胞。換用含終濃度50 mg·L－1ox-LDL的不同濃度Hcy的RPMI 1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h，觀察泡沫細(xì)胞形成，收集細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分組為 ① 對(duì)照組：0μmol·L－1Hcy泡沫細(xì)胞（單核細(xì)胞 ＋PMA＋ox-LDL）；②實(shí)驗(yàn)組：不同濃度 Hcy（50、100、200、500μmol·L－1）和 100μmol·L－1Hcy＋30μmol·L－1葉酸 ＋30μmol·L－1維生素 B12（100＋F＋V）干預(yù)泡沫細(xì)胞，每組3瓶。

1．3 油紅O染色觀察泡沫細(xì)胞形成 小心倒去培養(yǎng)液，用PBS緩沖液漂洗泡沫細(xì)胞3遍，4%多聚甲醛固定10 min，60%乙醇浸泡1 min，油紅O染色12 min，60%異丙醇分色3 min，37℃蒸餾水洗15 min，蘇木素染色1 min，蒸餾水洗后待干，用水性封固劑封片觀察。

1．4 巢式降落式甲基化特異性PCR（nMS-PCR）檢測(cè)ABCA1和ACAT1 DNA甲基化改變并分析兩者比值變化 提取細(xì)胞DNA并用核酸分析儀檢測(cè)OD260／OD280值，分析DNA樣品純度和濃度。通過甲基化引物在線設(shè)計(jì)軟件 http：／／www.urogene.org／methprimer／設(shè)計(jì)引物，見Tab 1。經(jīng)PCR擴(kuò)增后，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)甲基化和非甲基化程度。

Tab 1 Primer sequence used for nMS-PCR

1．5 ELISA-like檢測(cè)DNMTs活性 用細(xì)胞刮刀收集細(xì)胞，PBS洗滌3次，重懸于0.5 ml磷酸鈉緩沖液（pH＞7.4）中，超聲裂解細(xì)胞1 min，按照DNMTs活性分析試劑盒說明書操作，用比色法檢測(cè)泡沫細(xì)胞內(nèi)DNMTs的吸光度值，進(jìn)一步計(jì)算胞內(nèi)DNMTs活性。

1.6 細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量分析 收集細(xì)胞，用超聲細(xì)胞破碎儀破碎并收集上清，按照試劑盒說明書，采用化學(xué)酶促－比色法通過酶標(biāo)儀檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)總膽固醇含量（total cholesterol，TC）和游離膽固醇（free cholesterol，F(xiàn)C）含量，并計(jì)算：膽固醇酯（cholesterol ester，CE）含量（mmol·L－1）＝TC-FC。Lowry法測(cè)定總蛋白含量，計(jì)算膽固醇與細(xì)胞內(nèi)總蛋白的比值，分析膽固醇相對(duì)含量。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 結(jié)果用ˉx±s表示。兩樣本均數(shù)間比較用Student’s t檢驗(yàn)，多樣本均數(shù)間比較用One-way ANOVA檢驗(yàn)，組間的兩兩比較用Student-Newman-Keuls檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2．1 THP-1單核源性泡沫細(xì)胞培養(yǎng)和鑒定 THP-1單核細(xì)胞經(jīng)PMA刺激48 h后，細(xì)胞由懸浮變?yōu)橘N壁狀態(tài)，形狀呈長(zhǎng)梭形或不規(guī)則形并有偽足伸出，即單核細(xì)胞分化為巨噬細(xì)胞。再給予ox-LDL刺激48 h后，油紅O染色見細(xì)胞體積增大，胞內(nèi)充滿大量紅色脂滴，呈泡沫樣改變，細(xì)胞核呈藍(lán)色，即單核源性泡沫細(xì)胞形成，見Fig 1。

Fig 1 THP-1 monocyte-derived foam cells by oil red O staining（200×）

2．2 Hcy對(duì)THP-1單核源性泡沫細(xì)胞內(nèi)ABCA1和ACAT1 DNA甲基化的影響及比值MABCA1／ACAT1改變 不同濃度Hcy刺激泡沫細(xì)胞后，分析各組細(xì)胞中ABCA1和ACAT1 DNA甲基化水平，并計(jì)算DNA甲基化比值MABCA1／ACAT1的變化。結(jié)果顯示：與對(duì)照組比較，ABCA1 DNA甲基化程度在50、100、200、500μmol·L－1Hcy組分別增加了 38.28%、55.98%、47.12%、37.93%，給予100＋F＋V干預(yù)后，與100μmol·L－1Hcy組比較，ABCA1 DNA甲基化程度降低了28.34%；ACAT1 DNA甲基化程度以100μmol·L－1Hcy組低甲基化程度最明顯，較對(duì)照組降低了8.32%，但變化不如ABCA1明顯，給予100＋F＋V干預(yù)后，與100μmol·L－1Hcy組比較，ACAT1 DNA甲基化程度增加了14.95%；不同濃度Hcy誘導(dǎo)泡沫細(xì)胞形成過程中，與對(duì)照組比較，MABCA1／ACAT1分別增加了 31.37%、70.04%、43.29%、45.98%，而100＋F＋V組與100μmol·L－1Hcy組比較，MABCA1／ACAT1降低了 37.63%，見 Fig 2。

Fig 2 Changes of ABCA1 and ACAT1 DNA methylation levels

2．3 ELISA-like檢測(cè)DNMTs的活性 不同濃度Hcy使THP-1單核源性泡沫細(xì)胞DNMTs活性增加，以50μmol·L－1Hcy組活性最高，與對(duì)照組比較，差異有顯著性 （P＜0.01）；在 100μmol·L－1Hcy組，DNMTs活性與對(duì)照組比較也明顯增加（P＜0.05），見 Fig 3。

2.4 細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量分析 Hcy干預(yù)泡沫細(xì)胞后，胞內(nèi)膽固醇明顯增加，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較，差異有顯著性（P＜0.05）；胞內(nèi)膽固醇含量與Hcy濃度不呈量效關(guān)系，以100μmol·L－1Hcy組膽固醇含量增加最明顯（P＜0.01），這說明Hcy減少了泡沫細(xì)胞內(nèi)膽固醇流出，見Fig 4。

Fig 3 Hcy affects DNMTs activites of THP-1 monocyte-derived foam cells

Fig 4 Levels of cholesterol in foam cells（ˉx±s）

3 討論

ABCA1可介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)磷脂和游離膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)至載脂蛋白A-1，從而促進(jìn)高密度脂蛋白生成，啟動(dòng)膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)過程，在機(jī)體清除多余脂質(zhì)的過程中發(fā)揮重要作用［7］。ACAT1是一種催化膽固醇和脂肪酰輔酶A合成膽固醇酯的酶，在巨噬細(xì)胞及血管平滑肌細(xì)胞中，膽固醇作為極性脂分子，易滲入膜脂質(zhì)雙分子層中，構(gòu)成細(xì)胞膜，而剩余的膽固醇則在ACAT1的作用下生成膽固醇酯，由于膽固醇酯是高度非極性分子，主要以脂滴的形式儲(chǔ)存于胞質(zhì)中，細(xì)胞中過高濃度的膽固醇可形成結(jié)晶對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用，ACAT1的基本作用被認(rèn)為是減少過高的游離膽固醇對(duì)細(xì)胞的毒性作用［8］。

Hcy是一種含硫氨基酸，其作為甲硫氨酸代謝的中間產(chǎn)物，參與了甲硫氨酸循環(huán)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)［9］。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Hcy濃度升高引起DNMTs活性增加，這顯然不可能是Hcy引起基因組廣泛去甲基化的原因，而可能是細(xì)胞企圖扭轉(zhuǎn)基因組低甲基化的代償反應(yīng)。由于DNMTs的主要功能與維持甲基化狀態(tài)有關(guān)，因此，它很可能是某些已經(jīng)甲基化的CpG島保持甲基化狀態(tài)的關(guān)鍵因素，即DNMTs的上調(diào)很可能與Hcy在導(dǎo)致基因組DNA廣泛去甲基化的同時(shí)引起某些基因啟動(dòng)子區(qū)的高甲基化有關(guān)，這可以造成某些特定基因的沉默［10］。本次研究結(jié)果顯示，在Hcy干預(yù)下，THP-1單核源性泡沫細(xì)胞ABCA1基因啟動(dòng)子區(qū)DNA高甲基化也就是這個(gè)原因。這提示DNMTs活性的增加可能為對(duì)抗DNA去甲基化的一種代償反應(yīng)。

然而，泡沫細(xì)胞ACAT1啟動(dòng)子區(qū)DNA呈低甲基化改變，可能由于Hcy濃度增加，使S-腺苷同型半胱氨酸（S-adenosyl homocysteine，SAH）降解受阻，引起甲硫氨酸循環(huán)紊亂，關(guān)鍵酶功能失調(diào)所致，這又一次證實(shí)了Hcy引起基因組廣泛去甲基化的結(jié)論。ABCA1基因高甲基化和ACAT1基因低甲基化，共同促進(jìn)了泡沫細(xì)胞的形成，但ACAT1 DNA低甲基化程度不如ABCA1 DNA高甲基化程度明顯，即DNA甲基化比值MABCA1／ACAT1增大，提示Hcy干預(yù)THP-1單核源性泡沫細(xì)胞后，膽固醇從細(xì)胞內(nèi)流出明顯減少，而細(xì)胞內(nèi)膽固醇酯合成明顯增多，引起泡沫細(xì)胞內(nèi)脂滴聚集進(jìn)一步增多。ABCA1和ACAT1啟動(dòng)子區(qū)DNA甲基化改變與Hcy并不呈劑量依賴關(guān)系，且在葉酸和VitB12干預(yù)下有逆轉(zhuǎn)趨勢(shì)，多次重復(fù)試驗(yàn)均提示這一效應(yīng)并非偶然。綜上所述，Hcy可能影響了甲硫氨酸循環(huán)中DNMTs活性，導(dǎo)致AS相關(guān)基因DNA甲基化改變，進(jìn)而引起泡沫細(xì)胞形成過程中膽固醇代謝紊亂，此可能成為Hcy致AS的重要機(jī)制之一，這為我們進(jìn)一步認(rèn)識(shí)AS發(fā)病機(jī)制提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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