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    SSR分子標記技術(shù)在西瓜品種純度快速鑒定中的應(yīng)用研究

    2014-05-18 10:59:54田雅欄吳明生
    種子科技 2014年7期
    關(guān)鍵詞:標記技術(shù)純度西瓜

    牛 茜,田雅欄,吳明生

    (1.北京市種子管理站,北京 100088;2.北京市農(nóng)學院植物科學技術(shù)學院,北京 102206)

    SSR分子標記技術(shù)在西瓜品種純度快速鑒定中的應(yīng)用研究

    牛 茜1,田雅欄2,吳明生1

    (1.北京市種子管理站,北京 100088;2.北京市農(nóng)學院植物科學技術(shù)學院,北京 102206)

    根據(jù)雜交種帶型雙親互補的原則,從10對西瓜SSR引物中篩選出適合北京市主栽西瓜品種純度鑒定引物,其中品種京欣1號和京欣3號可鑒定的引物最多,均達到6對;京秀和航興天秀1號可鑒定引物最少,只有兩對。結(jié)合西瓜種仁DNA快速提取方法,利用篩選的引物對已知純度樣品進行鑒定,結(jié)果顯示SSR標記能準確鑒定樣品中混雜的親本種子,可用于西瓜雜交品種純度快速鑒定。

    西瓜;品種純度;SSR;快速鑒定

    西瓜是北京市主要農(nóng)作物,也是京郊農(nóng)業(yè)大力發(fā)展的特色經(jīng)濟作物之一,在北京常年種植面積達1萬hm2,因此保障西瓜種子質(zhì)量對京郊農(nóng)業(yè)發(fā)展具有重要意義。種子純度作為衡量種子質(zhì)量的4項重要指標之一,由于缺乏有效快速的室內(nèi)檢測方法,在質(zhì)量監(jiān)督檢驗中很少開展西瓜種子純度鑒定,這也間接影響著西瓜種子質(zhì)量的提高。

    近年來,隨著分子標記技術(shù)的快速發(fā)展,利用分子標記鑒定農(nóng)作物種子純度成為可能,目前在玉米[1]、水稻[2]等一些作物上取得很好效果,這也為西瓜種子純度快速鑒定提供了新的途徑。本文針對北京市目前主栽的7個西瓜品種,利用SSR分子標記技術(shù),篩選了可以進行純度鑒定的引物,同時利用篩選的引物對實際樣品進行了檢測,實現(xiàn)了純度室內(nèi)快速鑒定。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    京欣1號、京欣2號、京欣3號、京欣無籽1號、京秀、暑寶和航興天秀1號7個西瓜品種及其親本材料,均取自北京市審定農(nóng)作物標準樣品庫。

    1.2 生化試劑

    植物新型基因組DNA提取試劑盒、Taq酶、dNTPs、DNA Marker購自北京天根生化科技有限公司,PCR所用的10對SSR引物,由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成,其余試劑由北京化學試劑公司提供。

    1.3 DNA提取

    采用熱堿法快速提取。種子去殼后,將種仁放進深孔板中,向每個孔加入150 μL NaOH溶液(0.1 M),蓋膜后將深孔板放在桌面上水平來回搖晃10下,把深孔板放在沸水浴中加熱5 min后加入150 mL Tris-HCl溶液(10 mM、pH2.0),水平來回搖晃10下,上清液即可作為DNA模板用于擴增。

    1.4 SSR-PCR

    PCR 擴 增 體 系 包 括 MgCl22.5 mol/L、dNTPs 0.15 mol/L、引物0.25 μmol/L、Taq聚合酶0.1U、1×Taq Buffer、基因組DNA 1μL,補水至總體積為10 μL。擴增反應(yīng)在Eppendorf PCR儀 (Mastercycler nexus X1)上進行。PCR擴增程序:94℃5 min;94℃30 s,60℃35 s,72℃45 s,38個循環(huán);最后72℃延伸5 min,4℃保存。PCR擴增產(chǎn)物采用4.5%變性聚丙烯酰胺或3.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

    2 結(jié)果分析

    2.1 引物篩選

    采用10對SSR引物(序列信息見表1)對7個西瓜雜交品種組合進行篩選,依據(jù)雜交種帶型雙親互補的原則 (如圖1),7個西瓜品種都篩選出適合其純度鑒定的引物(見表2),其中京欣1號和京欣3號的可鑒定引物最多,達到6對;其次是暑寶,有5對引物可以鑒定;京秀和航興天秀1號可鑒定引物最少,只有兩對。

    10對引物中,不同的引物鑒定品種純度的能力差異較大,其中引物BVWS01843和BVWS00209能鑒定的品種最多,可以用于5個品種的鑒定,而引物BVWS00048和BVWS00333可鑒定的品種最少,均為1個。

    圖1 引物“BVWS00297”篩選的結(jié)果

    表1 10對SSR引物序列信息

    表2 西瓜品種純度鑒定引物表

    2.2 純度鑒定

    在京欣1號40粒雜交種樣品中摻入4粒父本和4粒母本,獲得已知純度的待測樣品。采用熱堿法提取西瓜單粒種子DNA,用互補帶片段大小差異較大的引物BVWS01843對該樣品進行檢測,PCR產(chǎn)物經(jīng)3.0%瓊脂糖凝膠電泳顯示該引物,能準確檢測出摻入的4粒父本和4粒母本種子(如圖2),檢出率達到100%,與實際相符,說明篩選的引物可有效鑒別西瓜雜交種與親本,適合西瓜品種純度快速檢測。

    圖2 利用引物BVWS01843對京欣1號樣品純度檢測結(jié)果(♂:父本,♀:母本)

    3 討論

    種子純度是種子質(zhì)量重要指標之一,有效的純度檢測方法將大大提高種子純度檢測的效率,對種子質(zhì)量的進一步提高具有重要意義。

    目前西瓜種子室內(nèi)純度檢測方法主要還是蛋白電泳法,但是該方法并不適合所有品種,而且電泳受環(huán)境影響大,技術(shù)穩(wěn)定性不是很高。

    本研究根據(jù)雙親互補原則,篩選出適合北京地區(qū)主栽西瓜雜交品種純度鑒定引物,可準確鑒定出樣品中混雜的親本材料。另外,結(jié)合西瓜種仁DNA快速提取方法,可以大大縮短DNA提取時間,實現(xiàn)純度樣品的快速、高效鑒定。

    目前單引物鑒定一般適合鑒定樣品中親本材料的污染。如果要鑒定異品種,就需要增加鑒定的引物數(shù)量,而相應(yīng)檢測工作量就會成倍增加,因此,下一步將通過優(yōu)化PCR反應(yīng)條件,建立多重引物的擴增體系,從而提高純度檢測的效率和準確性。

    [1]王鳳格,趙久然,郭景倫,等.適于玉米雜交種純度鑒定的SSR核心引物的確定[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學報,2007,15(6):964-969.

    [2]李召華,朱克永,陳祖武,等.SSR分子標記技術(shù)在雜交水稻種子純度鑒定中的應(yīng)用[J].雜交水稻,2006,21(4):11-14,47.

    1005-2690(2014)07-0037-02

    S511

    B

    2014-05-15

    北京市科技計劃項目(D131100000413001)。

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