齊留通通過(guò)激活ERK1／2信號(hào)通路減輕大鼠腦缺血炎癥反應(yīng)和缺血性腦損傷

涂獻(xiàn)坤，石松生，楊衛(wèi)忠，陳建屏，陳 琰，王立勝

（福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院神經(jīng)外科，福建省神經(jīng)外科研究所，福建福州 350001）

炎癥反應(yīng)是介導(dǎo)缺血性腦損傷最重要的病理生理機(jī)制之一，并且炎癥反應(yīng)已被廣泛認(rèn)為是治療缺血性腦中風(fēng)的重要靶點(diǎn)［1］。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，5-脂氧合酶（5-lipoxygenase，5-LOX）抑制劑 zileuton通過(guò)抑制炎癥反應(yīng)減輕大鼠缺血性腦損傷［2］。在腦缺血中，ERK1／2被認(rèn)為一種促神經(jīng)細(xì)胞生存的信號(hào)通路，研究表明，神經(jīng)保護(hù)劑Leptin通過(guò)激活ERK1／2信號(hào)通路減輕缺血性腦損傷［3］，但是 5-LOX抑制劑zileuton是否通過(guò)調(diào)節(jié)ERK1／2信號(hào)通路減輕腦缺血誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)及缺血性腦損傷，目前尚未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)對(duì)此進(jìn)行了初步的研究。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 TTC染料購(gòu)自美國(guó)Amersco公司，MPO檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成生物公司，ELISA試劑盒購(gòu)自廈門泰京生物公司，PD98059購(gòu)于Promega公司，Zileuton來(lái)自湖北鑫順源醫(yī)藥化工，p-ERK1／2和 t-ERK1／2抗體購(gòu)于Santa Cruz公司，蛋白提取試劑盒及檢測(cè)試劑盒購(gòu)于碧云天生物技術(shù)公司，水合氯醛由福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院提供。

1.2 動(dòng)物分組、動(dòng)物模型制備及腦室內(nèi)注射 清潔級(jí)♂SD大鼠，體質(zhì)量250～300 g，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供。隨機(jī)將大鼠分為4組，即對(duì)照組（sham）、腦缺血+溶媒處理組（MCAO）、腦缺血+zileuton治療組（zileuton）和腦缺血+zileuton治療+PD98059干預(yù)組（PD98059）。腦缺血后，zileuton 50 mg·kg-1用生理鹽水稀釋（無(wú)水酒精助溶），通過(guò)灌胃給藥，該劑量參考本課題組前期發(fā)表論文［2］。

腦缺血?jiǎng)游锬Ｐ蛥⒖颊n題組前期工作［4］，采用直徑0.32 mm的尼龍魚線，10%水合氯醛（0.3 ml／100 g）腹腔注射麻醉，鈍性分離右側(cè)頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈，結(jié)扎頸外動(dòng)脈。在頸外動(dòng)脈近分叉處剪一“V’形切口，插入備用魚線，用鑷子輕輕將栓線送至大腦中動(dòng)脈起始處，平均進(jìn)線（18.0±2.0）mm。

PD98059溶于DMSO，并用PBS稀釋成10μmol·L-1。在建立腦缺血模型時(shí)取10μl PD98059行腦室內(nèi)注射，運(yùn)用立體定向注射儀（深圳瑞奧德公司）。定向儀注射以前囟前方0.8 mm，中線外側(cè)1.5 mm為穿刺點(diǎn)，穿刺深度3.5 mm。

1.3 評(píng)估大鼠神經(jīng)功能損傷程度 根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的神經(jīng)功能損傷評(píng)分方法［5］，對(duì)腦缺血24 h大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分。0分，無(wú)神經(jīng)功能障礙；1分，提起大鼠尾巴對(duì)側(cè)前肢屈曲；2分，行走時(shí)地上打轉(zhuǎn)，靜止時(shí)身體無(wú)偏向?qū)?cè)；3分，行走時(shí)地上打轉(zhuǎn)，靜止時(shí)身體也偏向?qū)?cè)；4分，嚴(yán)重意識(shí)障礙。

1.4 測(cè)量腦梗死體積 腦缺血24 h，取鼠腦，沿冠狀位將鼠腦切成6片（前囟前方2片，后方4片），每片厚度約2 mm，放在2%TTC溶液中避光孵育20 min。正常腦組織呈鮮紅色，梗死腦組織呈白色。利用Photoshop等軟件測(cè)量各腦片梗死面積，并按如下公式計(jì)算腦梗死體積，V＝t×（A1+A2+…An），V為梗死體積，t為腦片厚度，A為梗死面積；數(shù)據(jù)采集以腦梗死比作統(tǒng)計(jì)，腦梗死體積／%＝（手術(shù)對(duì)側(cè)半球的體積-手術(shù)側(cè)半球未梗死部分的體積）／手術(shù)對(duì)側(cè)半球的體積×100%。

1.5 分析缺血腦組織含水量 分析腦含水量可作為評(píng)估腦水腫的依據(jù)。腦缺血24 h，取鼠腦，用濾紙吸除腦表面的水珠，稱重可獲得濕重（wet weights，WW），放烤箱烤干后，再稱重獲得干重（dry weights，DW），腦含水量計(jì)算公式：H2O／%＝（WW-DW）／WW×100%。

1.6 檢測(cè)缺血腦組織髓過(guò)氧化物酶水平 髓過(guò)氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）是中性粒細(xì)胞的標(biāo)志性物質(zhì)，通過(guò)檢測(cè)MPO的活性可獲得中性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)程度，從而間接反映腦缺血炎癥反應(yīng)的程度。腦缺血24 h取大鼠缺血腦組織，勻漿，按試劑盒說(shuō)明書步驟操作，并計(jì)算MPO活性。

1．7 ELISA檢測(cè)血漿TNF-α的含量 腦缺血24 h，采集血液，3 000 r·min-1離心后15 min獲得上清，將標(biāo)準(zhǔn)蛋白樣品和待測(cè)樣品加入包被好一抗的96孔板，按試劑盒說(shuō)明書步驟操作，最后測(cè)定OD值。根據(jù)已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)蛋白的OD值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各待測(cè)樣品的TNF-α含量。

1．8 W estern blot法檢測(cè)大腦 p-ERK1／2和 t-ERK1／2的含量 腦缺血24 h，取大鼠缺血腦組織，蛋白提取試劑盒提取總蛋白，并測(cè)定蛋白濃度。經(jīng)灌膠、上樣、凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜等步驟后，一抗4℃孵育過(guò)夜，二抗室溫孵育2 h，然后經(jīng)顯影、定影、圖像采集等，用Quantity one軟件分析蛋白條帶。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 統(tǒng)計(jì)結(jié)果以表示，統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用單因素方差分析（ANOVA），兩兩比較選用LSD法分析，用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件處理。

2 結(jié)果

2．1 Zileuton減輕神經(jīng)功能損傷和腦梗死體積的作用被PD98059抑制 假手術(shù)組大鼠無(wú)神經(jīng)功能障礙，腦缺血24 h大鼠神經(jīng)功能損傷評(píng)分明顯增高（2.67±0.51，P＜0.01），zileuton 50 mg·kg-1治療組明顯減輕大鼠腦缺血誘導(dǎo)的神經(jīng)功能損傷（1.5±0.54，P＜0.05），這種作用被 PD98059抑制（2.5±0.55，P＜0.05，n＝6）。

假手術(shù)組未見(jiàn)腦梗死，腦缺血24 h大鼠腦梗死比明顯增大（0.411±0.015，P＜0.01），zileuton 50 mg·kg-1治療組大鼠腦梗死比（0.228±0.036）明顯小于溶媒組腦梗死比（P＜0.05），這種作用被PD98059抑制（0.342±0.035，P＜0.05，n＝6）。

2．2 Zileuton減輕缺血性腦水腫的作用被PD98059抑制 大鼠腦缺血24 h缺血側(cè)腦組織含水量（84.7±3.1）%和假手術(shù)組（73.6±1.1）%相比明顯增高（P＜0.01），zileuton 50 mg·kg-1組（79.7±2.4）%明顯減小大鼠腦含水量（P＜0.01），這種作用被 PD98059抑制（82.1±1.8）%，（P＜0.05，n＝6）。

2．3 Zileuton降低MPO活性的作用被PD98059抑制 大鼠腦缺血24 h缺血腦組織MPO活性明顯增高（P＜0.01），zileuton 50 mg·kg-1可減輕缺血腦組織MPO的活性，即抑制腦缺血誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，這種抗炎癥反應(yīng)作用被PD98059抑制（Tab 1）。

2．4 Zileuton降低TNF-α表達(dá)的作用被PD98059抑制 大鼠腦缺血24 h血漿TNF-α的水平增高（P＜0.01），zileuton 50 mg·kg-1可明顯降低血漿 TNF-α的水平，這種抑制TNF-α表達(dá)的作用被腦室內(nèi)注射的PD98059抑制（Tab 1）。

Tab 1 Zileuton reduces MPO activity and TNF-αcontent in rats of cerebral ischem ia via modulating ERK 1／2 signaling pathway

Tab 1 Zileuton reduces MPO activity and TNF-αcontent in rats of cerebral ischem ia via modulating ERK 1／2 signaling pathway

**P＜0.01 vs sham group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs MCAO group；△P＜0.05 vs zileuton-treated group.

Group MPO activity TNF-αcontent Sham 0.136±0.012 7.37±1.01 MCAO 0.475±0.024 20.7±2.58**Zileuton 50 mg·kg-1 0.356±0.052**#16.45±1.35**##LY294002+Zileuton 0.415±0.031**△ 19.97±2.1**△

2．5 Zileuton激活 ERK1／2信號(hào)通路的作用被PD98059抑制 大鼠腦缺血24 h缺血腦組織p-ERK1／2的蛋白表達(dá)明顯降低（P＜0.01），而 t-ERK1／2的蛋白表達(dá)不變（P＞0.05）。Zileuton 50 mg·kg-1明顯上調(diào)缺血腦組織p-ERK1／2的蛋白表達(dá)水平（P＜0.01），而對(duì)t-ERK1／2的蛋白表達(dá)沒(méi)有影響（P＞0.05）。Zileuton上調(diào)p-ERK1／2表達(dá)的作用被 PD98059抑制（P＜0.05），PD98059對(duì) t-ERK1／2的蛋白表達(dá)沒(méi)有影響（P＞0.05），見(jiàn) Fig 1。

Fig 1 Zileuton up-regulates the expression of p-ERK1／2 in rats of cerebral ischem ia，which is inhibited by PD98059 adm inistration±s，n＝6）*P＜0.05，**P＜0.01 vs sham group；##P＜0.01 vs MCAO group；△P＜0.05 vs zileuton-treated group.

3 討論

急性缺血性腦中風(fēng)的治療包括兩個(gè)方面：溶栓治療和神經(jīng)保護(hù)治療［6］。阿替普酶是目前急性缺血性腦中風(fēng)溶栓治療的最有效的藥物，但是溶栓治療的時(shí)間窗只有3～4.5 h［7］，這么短的治療時(shí)間窗導(dǎo)致了臨床上實(shí)際能夠接受溶栓治療的病人不足2.1%［8］。探索新的神經(jīng)保護(hù)措施或神經(jīng)保護(hù)藥物，提高缺血神經(jīng)細(xì)胞的耐受性，彌補(bǔ)溶栓治療的不足，目前已成為全世界的研究熱點(diǎn)。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，腦缺血后5-LOX表達(dá)增高，5-LOX抑制劑zileuton可抑制腦缺血5-LOX的表達(dá)從而減輕大鼠腦缺血損傷［9］，此外zileuton可抑制炎癥反應(yīng)、血腦屏障破壞和神經(jīng)元凋亡減輕缺血性損傷［2，10］，但其潛在的分子機(jī)制目前尚未完全明確。

本項(xiàng)研究利用已成功建立的大鼠腦缺血模型，借助腦立體定向儀將 ERK1／2的特異性抑制劑PD98059注射腦室內(nèi)，用于干預(yù)ERK1／2信號(hào)通路。結(jié)果顯示，zileuton可減輕大鼠腦缺血誘導(dǎo)的神經(jīng)功能障礙，減小腦梗死體積，減輕缺血性腦水腫，這3個(gè)方面說(shuō)明zileuton可減輕大鼠缺血性腦損傷，對(duì)腦缺血具有神經(jīng)保護(hù)作用。上述zileuton的3種作用均被腦室內(nèi)注射的PD98059所抑制，這充分表明zileuton對(duì)腦缺血的神經(jīng)保護(hù)作用和調(diào)節(jié)ERK1／2信號(hào)通路有關(guān)。已知zileuton通過(guò)抑制炎癥反應(yīng)減輕缺血性腦損傷，本研究發(fā)現(xiàn)zileuton抗炎癥反應(yīng)的作用也被腦室內(nèi)注射的PD98059所抑制，這說(shuō)明zileuton是通過(guò)調(diào)節(jié)ERK1／2信號(hào)通路減輕腦缺血炎癥反應(yīng)。因此，5-LOX抑制劑是通過(guò)調(diào)節(jié)ERK1／2信號(hào)通路減輕炎癥反應(yīng)，進(jìn)而減輕缺血性腦損傷。

為了證實(shí)zileuton是如何調(diào)節(jié)ERK1／2信號(hào)通路，我們檢測(cè)了信號(hào)通路的關(guān)鍵蛋白p-ERK1／2和t-ERK1／2的蛋白表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)腦缺血后p-ERK1／2的表達(dá)下降，這和ERK1／2信號(hào)通路促神經(jīng)細(xì)胞生存的說(shuō)法是完全一致的，但t-ERK1／2的表達(dá)沒(méi)有變化，這和ERK1／2磷酸化激活的理論也是一致的［11］。Zileuton可以上調(diào) p-ERK1／2的表達(dá)，對(duì)t-ERK1／2沒(méi)有影響，說(shuō)明 zileuton激活腦缺血ERK1／2信號(hào)通路具備可能性；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)zileuton上調(diào)p-ERK1／2表達(dá)的作用被腦室內(nèi)注射的PD98059抑制，這說(shuō)明zileuton通過(guò)激活ERK1／2信號(hào)通路并發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。因此，zileuton對(duì)腦缺血的神經(jīng)保護(hù)作用和抗炎癥反應(yīng)的作用是通過(guò)激活ERK1／2信號(hào)通路起作用。但是，zileuton的抗炎癥反應(yīng)是否與其抑制5-LOX表達(dá)有關(guān)，目前沒(méi)有明確的結(jié)論。腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）是一種炎癥性細(xì)胞因子，在腦缺血性損傷的病理生理過(guò)程中起重要作用，可加重炎癥反應(yīng)從而介導(dǎo)腦損傷［12］。腦缺血 TNF-α的表達(dá)升高，zileuton可抑制TNF-α的表達(dá)，這種作用也被腦室內(nèi)注射的PD98059所抑制，這進(jìn)一步表明zileuto的抗炎癥作用和ERK1／2信號(hào)通路的激活有關(guān)。綜上所述，zileuton通過(guò)激活ERK1／2信號(hào)通路減輕大鼠腦缺血炎癥反應(yīng)和缺血性腦損傷。

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