EGCG通過抑制p75NTR通路對APP／PS1小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙的改善作用

楊時倫，劉明妍，鐘 欣，杜 可，姚維范，趙海山，魏敏杰

（中國醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥理學(xué)教研室，遼寧沈陽 110001）

阿爾采末?。ˋlzheimer’s disease，AD）是以進行性認知障礙為其主要特征的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，其典型的病理改變?yōu)樯窠?jīng)細胞間出現(xiàn)大量以β-淀粉樣肽（β-amyloid，Aβ）為核心的老年斑（senile plaques，SP）及神經(jīng)元丟失等［1-2］。研究表明，β-淀粉樣肽前體蛋白（β-amyloid precursor protein，APP）在β-分泌酶的作用下水解產(chǎn)生大量Aβ沉積，Aβ的大量沉積通過氧化應(yīng)激、鈣超載、細胞調(diào)亡等方式啟動了神經(jīng)細胞發(fā)生退行性改變，出現(xiàn)AD樣病變［3-4］。而神經(jīng)細胞生存能力降低和細胞凋亡是導(dǎo)致AD的功能退化和神經(jīng)變性的基礎(chǔ)和最后轉(zhuǎn)歸，p75NTR是神經(jīng)生長因子（NGF）的低親和力受體，主要介導(dǎo)神經(jīng)細胞的凋亡，已有文獻報道，p75NTR在AD腦組織中高表達。而當(dāng)p75NTR信號通路被活化時，將觸發(fā)凋亡相關(guān)JNK通路，并通過影響其下游凋亡相關(guān)蛋白的表達，從而最終導(dǎo)致神經(jīng)元退化、凋亡以及學(xué)習(xí)記憶障礙［4-7］。因此，發(fā)現(xiàn)一種能夠抑制AD腦內(nèi)p75NTR信號通路的活化，且可有效改善AD癥狀的新藥，并對其進行相關(guān)機制的探討，對于深入研究AD具有較大的意義。

（-）表沒食子兒茶素沒食子酸酯（epigallocatechin-3-gallate，EGCG）是綠茶的一種主要多酚成分，具有抗氧化應(yīng)激、抗炎和抗癌等作用［8］。已有報道EGCG在體外對3-HK誘導(dǎo)的人神經(jīng)母細胞瘤SHSY5Y細胞，轉(zhuǎn)染瑞典型人類APP基因突變的嚙齒類神經(jīng)元樣 N2a細胞，APP過表達 TgAPPsw line 2576單轉(zhuǎn)基因小鼠原代神經(jīng)細胞，以及對D-半乳糖誘導(dǎo)的AD小鼠、TgAPPsw line 2576單轉(zhuǎn)基因小鼠、PS2單轉(zhuǎn)基因小鼠具有神經(jīng)保護作用［9］，但尚未見有關(guān)EGCG通過調(diào)節(jié)NGF相關(guān)TrkA／p75NTR平衡發(fā)揮抗AD作用的報道。本研究首次以APP／PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠為研究對象研究EGCG的抗AD作用，并從EGCG抑制p75NTR信號通路的角度，探討其改善APP／PS1轉(zhuǎn)基因小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙及抑制其腦內(nèi)神經(jīng)細胞凋亡的可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 C57 BL／6J小鼠10只，♂♀各半，9月齡，（21±4）g；APP／PS1轉(zhuǎn)基因小鼠 20只，♂♀各半，9月齡，體質(zhì)量（19±3）g，由中國醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供。實驗過程中的動物飼養(yǎng)及取材均遵守實驗動物管理和保護的有關(guān)規(guī)定。

1.2 藥物處理 對照組（WT組）：9月齡C57 BL／6J小鼠10只，♂♀各半，每日等量于實驗組的雙蒸水灌胃，每日1次，連續(xù)灌胃4周；模型組（APP／PS1組）：9月齡APP／PS1轉(zhuǎn)基因小鼠10只，♂♀各半，每日等量于實驗組的雙蒸水灌胃，每日1次，連續(xù)灌胃4周；治療組（EGCG-treated APP／PS1組）：9月齡APP／PS1轉(zhuǎn)基因小鼠10只，♂♀各半，每天按2 mg·kg-1體重灌胃0.02%的EGCG水溶液（EGCG，純度＞95%，購自Sigma公司），每日1次，連續(xù)灌胃4周。4周給藥結(jié)束后，即可開始行為學(xué)試驗，行為學(xué)試驗結(jié)束后，處死動物，取皮質(zhì)及海馬，或組織固定。

1.3 行為學(xué)試驗

1.3.1 避暗試驗 4周給藥結(jié)束后，參照Galeotti等［9］的方法，開始被動避暗試驗，分為訓(xùn)練和正式試驗兩個階段：訓(xùn)練前將小鼠頭背著洞口放入明室（BA-200避暗自動測試儀，成都泰盟科技有限公司），先適應(yīng)環(huán)境3 min，然后給暗室銅柵通以36 V電流，小鼠一進入暗室即受電擊，其正確反應(yīng)是回到明室，銅柵通電持續(xù)5 min，此為訓(xùn)練過程。24 h后對小鼠進行記憶測驗，記錄小鼠第1次進入暗室的時間，此為避暗潛伏期，并記錄5 min內(nèi)小鼠進入暗室的次數(shù)（即避暗錯誤次數(shù)），5 min內(nèi)未進入暗室的小鼠其潛伏期按300 s計算。

1.3.2 Morris水迷宮試驗 在被動避暗試驗結(jié)束后，參照 Morris等［10］的方法，開始 Morris水迷宮試驗（Morris水迷宮裝置購自北京碩林苑生物科技有限公司）。參照Morris方法進行，分為訓(xùn)練期、定向航行試驗和空間搜索試驗3部分進行。訓(xùn)練期：在定向航行試驗前1天，水池中不放置平臺，使小鼠在水中自由游泳2 min，使其適應(yīng)環(huán)境。定向航行試驗：進行定向航行試驗時，將平臺放在固定的第二象限，不再移動。該試驗訓(xùn)練小鼠每天4次，共5 d。訓(xùn)練時，將小鼠面向池壁從4個入水點分別放入水池，記錄鼠入水到找到水下隱蔽平臺并站立于其上所需時間，作為潛伏期（latency），用秒（s）表示，并記錄從小鼠如水至找到平臺通過路徑的總長度，用厘米（cm）表示。小鼠找到平臺后，讓其在平臺上站立30 s。入水后60 s若小鼠仍未能找到平臺，則將其輕輕從水中引導(dǎo)拖上平臺，并停留30 s，然后進行下一次訓(xùn)練。每只鼠從4個入水點分別放入水池為一次訓(xùn)練，兩次訓(xùn)練之間間隔120 s?？臻g搜索試驗：在定向航行試驗結(jié)束后，也就是d 6，將平臺撤去，使其在水中尋找原平臺所在位置，共120 s，記錄從小鼠第1次到達平臺原來所在位置的時間（latency），用秒（s）表示，以及小鼠穿越原平臺的次數(shù)，來評價小鼠記憶重現(xiàn)的能力。

1.3.3 自主活動試驗 將小鼠放入自主活動箱中（ZZ-6小鼠自主活動測試儀，成都泰盟科技有限公司），記錄小鼠10 min內(nèi)自主活動次數(shù)（locomotivity）和站立次數(shù)（stand-up）。

1．4 TUNEL法檢測小鼠腦組織中神經(jīng)元形態(tài)和細胞凋亡水平 石蠟切片按照TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒（購自Roch公司）說明書進行，石蠟切片脫蠟、水化后，3%的H2O2室溫處理10 min，TBS洗3次后，加20 mg·L-1蛋白酶K工作液37℃消化15 min，TBS洗后加入TUNEL反應(yīng)體系混合液37℃反應(yīng)2 h，封閉30 min；37℃下生物素化的抗地高辛抗體孵育30 min，過氧化物酶-DAB反應(yīng)體系對凋亡細胞進行染色，觀察各組每100個細胞TUNEL陽性細胞表達率（即凋亡指數(shù)）。

1．5 Fluoro-Jade B法檢測小鼠腦組織中神經(jīng)元退行性變化 石蠟切片脫蠟、水化后，無水乙醇脫水5 min，80%乙醇脫水5 min，70%乙醇脫水2 min，雙蒸水漂洗2 min。浸入0.06%高錳酸鉀溶液15 min后，轉(zhuǎn)入雙蒸水中漂洗2 min；然后浸入0.0004%FJB染液中反應(yīng)30 min，再在蒸餾水漂洗1 min，反復(fù)3次，晾干后，二甲苯透明1 min，最后用中性樹膠（DPX）封片。在熒光顯微鏡下采用藍色濾色片（激發(fā)光波長為450～490 nm）觀察并采集圖像。觀察各組每mm2FJB陽性細胞表達數(shù)。

1．6 W estern blot檢測小鼠腦組織中相關(guān)蛋白表達 各組小鼠海馬組織，放入預(yù)冷的RIPA Buffer裂解緩沖液［50 mmol·L-1Tris-HCl buffer pH 8.0 containing 150 mmol·L-1NaCl，1%NP-40，0.5%sodium deoxycholate，0.1%sodium dodecyl sulphate，購自碧云天生物技術(shù)研究所；0.1%phenylmethyl sulfonylfluoride（PMSF），購自 Roche公司］中，冰上勻漿后，4℃12 000×g×30 min，取上清，BCA法蛋白定量（BCA試劑盒，購自碧云天生物技術(shù)研究所）。每孔蛋白上樣量50μg，SDS-PAGE電泳分離蛋白并電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。5%脫脂奶粉或5%BSA的TBST中室溫封閉2 h，一抗4℃過夜（兔抗p75ICD抗體（1∶500，cell signalling）；兔抗 JNK2、Phospho-JNK2（FL）抗體 （1∶600，Santa Cruz Biotechnology），鼠抗 caspase-3（DO-1）抗體 （1∶500，Santa Cruz Biotechnology），兔 抗 或 鼠 抗 β-actin（1∶2 000，1∶2 000，Santa Cruz Biotechnology）室溫孵育2 h，ECL顯影（SuperECL Plus超敏發(fā)光液購自北京普利萊基因技術(shù)公司）。

1.7 數(shù)據(jù)處理 試驗數(shù)據(jù)采用SPSS16.0統(tǒng)計分析軟件包進行統(tǒng)計學(xué)處理，數(shù)據(jù)以s表示。組間比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），兩兩比較采用Turkey’s post hoc test法進行統(tǒng)計學(xué)分析；行為學(xué)試驗中穿梭次數(shù)及錯誤次數(shù)，使用非參檢驗Kruskal-Wallis H test法進行統(tǒng)計學(xué)分析。

2 結(jié)果

2．1 EGCG有效改善APP／PS1小鼠的學(xué)習(xí)記憶障礙 為了考察EGCG對APP／PS1小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響，我們分別采用被動避暗試驗和Morris水迷宮試驗來各組小鼠的與學(xué)習(xí)記憶相關(guān)的行為學(xué)改變。

首先，我們通過被動避暗試驗分別對各組小鼠避暗潛伏期（Fig 1A）和進入暗室錯誤次數(shù)（Fig 1B）對各組小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響進行了考察，發(fā)現(xiàn)EGCG可使APP／PS1小鼠的避暗潛伏期明顯延長（P＜0.01），進入暗室的次數(shù)明顯減少（P＜0.01），初步說明EGCG可改善APP／PS1轉(zhuǎn)基因小鼠的學(xué)習(xí)記憶障礙。

Fig 1 Effects of EGCG treatment on learning and memoryperformance in APP／PS1 m ice by passive avoidance test（n＝10）A：the latency；B：the frequencies of entering the dark compartment；Resultswere expressed as values of latency and the frequencies of entering the dark compartment obtained from each group and analyzed by one-way ANOVA and Kruskal-Wallis H test，respectively.**P＜0.01 vs WT group；##P＜0.01 vs APP／PS1 group.

接著，我們又通過Morris水迷宮試驗連續(xù)5 d考察定向航行試驗中尋找平臺潛伏期（Fig 2A）及尋找路徑長度（Fig 2B）的變化發(fā)現(xiàn)，在定位巡航試驗的d 1，各組小鼠的尋找平臺潛伏期和路徑長度差異無顯著性（P＞0.05）；而經(jīng)過d 2～5定位巡航試驗的學(xué)習(xí)過程后，EGCG可使APP／PS1組小鼠尋找平臺潛伏期和路徑長度明顯縮短（P＜0.01），并呈現(xiàn)出明顯的學(xué)習(xí)與記憶的獲得曲線。在d 6撤去平臺后的空間探索實驗中，我們又考察了各組小鼠在原平臺所在目的象限的停留時間和原平臺所在位置的穿梭次數(shù)的差異對其記憶再現(xiàn)能力（Fig 3），發(fā)現(xiàn)EGCG可明顯延長APP／PS1小鼠在目的象限的停留時間和穿梭次數(shù)（P＜0.01），這進一步證明了EGCG可改善APP／PS1小鼠的學(xué)習(xí)記憶障礙。

最后，應(yīng)用自主活動試驗來考察各組小鼠自主活動次數(shù)（Fig 4A）和站立次數(shù)（Fig 4B）的差異。結(jié)果顯示，各組小鼠10 min內(nèi)站立次數(shù)與自主活動次數(shù)差異均無顯著性（P＞0.05），這提示APP／PS1小鼠的活動能力未受影響，上述行為學(xué)指標的改變確實是由于學(xué)習(xí)記憶障礙所引起的，而并非由于小鼠活動能力的改變而引起的。

Fig 3 Effects of EGCG treatment on learning and memory performance in APP／PS1 m ice by probe trial of M orriswater maze（n＝10）A：time spent in targetquadrant；B：frequencies passing through the goal；Results were expressed asmean±SD values of the time spent in target quadrantand the frequenciespassing through the goal obtained from each group and analyzed by one-way ANOVA and Kruskal-Wallis H test，respectively.**P＜0.01 vs WT group；##P＜0.01 vs APP／PS1 group.

2．2 EGCG明顯抑制APP／PS1轉(zhuǎn)基因小鼠海馬的神經(jīng)細胞凋亡 本課題組前期工作已經(jīng)證實，EGCG可明顯降低Aβ1-40和APP蛋白表達水平，而也有研究證明Aβ1-40和APP的沉積具有神經(jīng)細胞毒性，可誘導(dǎo)神經(jīng)細胞發(fā)生凋亡［2-4］。因此，我們進一步以TUNEL法，就EGCG對APP／PS1小鼠海馬中神經(jīng)細胞凋亡水平進行了考察，發(fā)現(xiàn)EGCG可明顯降低APP／PS1小鼠海馬的TUNEL陽性細胞表達和凋亡指數(shù)（P＜0.01，見Fig 5），這說明EGCG可明顯抑制APP／PS1小鼠海馬的神經(jīng)細胞凋亡，發(fā)揮抗凋亡作用。

Fig 4 Effects of EGCG treatment on locomotivity performance in APP／PS1 m ice by navigation test of M orris water maze（n＝10）A：locomotivity；B：stand-up；Results were expressed ass values of the data obtained from each group and analyzed by Kruskal-Wallis H test.

Fig 5 Effects of EGCG treatment on neuronal apoptosis in hippocam pus of APP／PS1 m ice by TUNEL staining（n＝5）Results were expressed ass values of data obtained from each group and analyzed by one-way ANOVA.**P＜0.01 vs WT group；##P＜0.01 vs APP／PS1 group.

2．3 EGCG明顯抑制APP／PS1轉(zhuǎn)基因小鼠海馬的神經(jīng)細胞退行性改變 我們以TUNEL法發(fā)現(xiàn)了EGCG可抑制APP／PS1小鼠海馬中神經(jīng)細胞的凋亡水平，因此，我們進一步用特異性檢測細胞退行性改變的Fluoro-Jade B法考察了EGCG對神經(jīng)細胞退行性改變的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，EGCG可明顯降低APP／PS1小鼠海馬的 FJB陽性細胞表達量（P＜0.01，見Fig 6），這說明EGCG明顯抑制APP／PS1小鼠海馬的神經(jīng)細胞退行性變，發(fā)揮抗AD作用。

Fig 6 Effects of EGCG treatment on neurodegenerative levels in hippocam pus of APP／PS1 m ice by Fluoro-Jade B staining（n＝3）Results were expressed values of the data obtained from each group and analyzed by one-way ANOVA.**P＜0.01 vs WT group；##P＜0.01 vs APP／PS1 group.

2．4 EGCG抑制p75NTR信號通路的平衡發(fā)揮其抗AD作用 如前所述，EGCG能明顯抑制APP／PS1轉(zhuǎn)基因小鼠海馬內(nèi)神經(jīng)細胞凋亡及退行性改變，從而發(fā)揮神經(jīng)保護作用。接下來，我們對EGCG是否通過調(diào)節(jié)APP／PS1轉(zhuǎn)基因小鼠海馬p75NTR信號通路而發(fā)揮其抗AD作用進行了考察。

本研究通過考察對EGCG對p75NTR信號通路及其下游底物的影響，發(fā)現(xiàn)EGCG可使APP／PS1組小鼠海馬內(nèi)p75NTR的剪切產(chǎn)物p75ICD表達水平明顯降低，并明顯降低其下游JNK2的磷酸化水平與凋亡相關(guān)蛋白p53和cleaved-caspase 3蛋白表達水平（P＜0.01，見Fig 7），這表明EGCG可在激活 NGF相關(guān)TrkA通路的同時，抑制p75NTR通路的活化，繼而減低p53與cleaved-caspase 3的表達，從而發(fā)揮抑制海馬神經(jīng)細胞凋亡、改善學(xué)習(xí)記憶的作用。

3 討論

APP／PS1轉(zhuǎn)基因小鼠具有腦內(nèi)出現(xiàn)Aβ沉積時間早，且產(chǎn)生Aβ量多，同時多伴有膠質(zhì)細胞增生，神經(jīng)元丟失以及學(xué)習(xí)記憶功能障礙等的特點，能夠較好地模擬出類似于AD患者的病理變化和行為學(xué)變化而倍受研究者重視，已成為研究AD發(fā)病機制及藥物開發(fā)理想的動物模型。本研究首次通過調(diào)節(jié)腦內(nèi) p75NTR信號通路這一新的作用機制，探討EGCG改善9月齡APP／PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠抗AD作用及其機制進行了研究。研究發(fā)現(xiàn)，EGCG可改善APP／PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠的學(xué)習(xí)記憶障礙（Fig 1～4），并明顯抑制神經(jīng)細胞凋亡及退行性改變（Fig 5，6），這提示著EGCG對APP／PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠具有抑制細胞凋亡、改善認知能力障礙等抗AD作用。

Fig 7 Effects of EGCG treatment on p75NTR-mediated JNK signaling in hippocampus of APP／PS1 m ice by W estern blot（n＝3）A：p75ICDexpression level；B：the activation levels of JNK2；C：p53 expression level；D：cleaved-caspase3expression level；Quantification of protein blots was shown，β-actin levels were normalized to be a loading control.Each bar represents themean relative protein level of each group.Results were expressed as values of the data obtained from each group and analyzed by one-way ANOVA.**P＜0.01 vs WT group；##P＜0.01 vs APP／PS1 group.

有研究發(fā)現(xiàn)，p75NTR在許多中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中表達增高并參與神經(jīng)元的凋亡，如AD、多發(fā)性硬化癥、肌萎縮性側(cè)索硬化、脊髓損傷和腦缺血等。而且，也有研究報道［14］Aβ直接與 p75NTR結(jié)合，在多個細胞培養(yǎng)株中誘導(dǎo)凋亡，尤其是誘導(dǎo)與AD有關(guān)的神經(jīng)元細胞凋亡。聚集的Aβ1-40和Aβ1-42會促進c-jun磷酸化，作為p75NTR介導(dǎo)的細胞凋亡的早期事件。p75NTR首先在細胞外被剪切產(chǎn)生一個20 ku的細胞內(nèi)區(qū)域（p75ICD），p75ICD可易位到細胞核，這一過程伴隨著延緩的凋亡［47］。這提示p75NTR可介導(dǎo)神經(jīng)細胞凋亡，并與Aβ的沉積和學(xué)習(xí)記憶密切相關(guān)［5］。在對anti-NGF AD11模型小鼠的研究發(fā)現(xiàn)，p75NTR受體的激活可誘導(dǎo)神經(jīng)細胞導(dǎo)致其發(fā)生凋亡，進而發(fā)生認知障礙，這提示著p75NTR介導(dǎo)的信號通路在神經(jīng)細胞凋亡中發(fā)揮了重要的作用，參與AD發(fā)生發(fā)展調(diào)控。因此，本研究考察了EGCG對p75NTR通路的作用，發(fā)現(xiàn)EGCG可下調(diào)p75NTR的剪切活性，抑制p75NTR通路的活化，進而抑制其下游JNK通路，并使其下游凋亡相關(guān)蛋白p53和cleaved-caspase 3表達降低（Fig 7），從而發(fā)揮抗凋亡的作用。

綜上結(jié)果所示，EGCG主要通過抑制p75NTR通路及其介導(dǎo)的下游JNK通路及其凋亡相關(guān)下游底物，抑制神經(jīng)細胞凋亡及退行性改變，改善學(xué)習(xí)記憶障礙，發(fā)揮抗AD作用。

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