激動ALDH2對抗糖尿病大鼠肝臟損傷的機制探討

張冠軍，康品方，宗巧鳳，于 影，王芳芳，高 琴

（1.蚌埠醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室，安徽蚌埠 233030；2.蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科，安徽蚌埠 233004）

糖尿病是一種慢性進行性內(nèi)分泌及代謝性疾病，隨著生活水平的提高，其發(fā)病率越來越高，目前全球糖尿病患者已超過7億。糖尿病作為一種慢性疾病嚴重危害著人們的身體健康。糖尿病的病程較長，在其病情不斷加重的過程中伴有多種并發(fā)癥，肝臟損傷是其中之一，主要表現(xiàn)為慢性炎癥和肝功能的損傷［1］。

乙醛脫氫酶2（aldehyde dehydrogenase 2，ALDH2）是線粒體內(nèi)重要的醛類氧化酶，與生物氧化關(guān)系密切，可防止乙醛對膜的脂質(zhì)過氧化，是機體內(nèi)重要的保護因子之一［2］。ALDH2廣泛分布于肝臟、心臟、肺臟和腦等組織中。Murata等［3］觀察到少量或適量的外源性乙醇可以激動ALDH2的表達。本實驗室前期已觀察到激動ALDH2可以減輕糖尿病大鼠心肌損傷［4］。氧化應(yīng)激異常是糖尿病肝損傷發(fā)生慢性炎癥和肝功能損傷的重要機制［1］，糖尿病大鼠肝組織中由于過氧化氫酶、超氧化物歧化酶活性降低，不能及時清除氧自由基，引起肝細胞DNA損傷的發(fā)生［5］。大量研究顯示，線粒體ALDH2具有抗氧化應(yīng)激損傷的作用，但激動ALDH2是否對糖尿病大鼠的肝臟損傷有保護作用至今報道較少。Martinovic等［5］在對糖尿病大鼠肝臟的研究中觀察到：在肝功能損害的過程中存在著JNK（c-Jun N-terminal kinase）通路的激活。Kaneto等［6］觀察到 JNK抑制劑使小鼠血糖降低且并發(fā)癥減少。激動ALDH2是否可通過抑制JNK通路減弱糖尿病誘導(dǎo)的肝臟的損傷呢？因此，本實驗建立糖尿病大鼠肝臟損傷模型，應(yīng)用低劑量乙醇激動ALDH2使之高表達，觀察ALDH2高表達是否可對抗糖尿病肝臟損傷，并進一步觀察激動ALDH2能否通過抑制JNK通路而對抗糖尿病肝臟損傷。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 清潔級健康♂SD大鼠，體質(zhì)量200～220 g，蘇州工業(yè)園區(qū)愛爾麥特科技有限公司提供，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（蘇2009-001）。

1.1.2 儀器、藥品和試劑 鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）購自 Sigma公司，批號：905B0311；乙醇（ethanol，EtOH）購自安徽安特食品股份有限公司，批號：1212073601；ALDH2、β-actin抗體購自美國Santa Cruz公司；p-JNK、JNK抗體購自 Anbo公司；羊抗小鼠及羊抗兔二抗購自武漢博士德公司；ECL發(fā)光試劑盒購自Millipore公司。采用易速得血糖分析儀及配套的臺欣試紙測定大鼠空腹血糖變化；立式超低溫冰箱（海爾公司，中國），酶標儀（BioTek，美國），水平低溫離心機（Centrifuge 5810R，美國），電泳儀（Bio-RAD，美國 ），電轉(zhuǎn)槽（Bio-RAD，美國）；全自動凝膠分析儀（Chmi DocTMXRS+，美國）。

1.2 方法

1.2.1 糖尿病模型復(fù)制及分組 ♂SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后隨機分為3組，每組10只，分為正常對照組（Con組）、糖尿病組（DM組）、ALDH激動劑乙醇加糖尿病組（EtOH+DM組）。一次性腹腔注射STZ 55mg·kg-1復(fù)制糖尿病大鼠模型，72 h后尾靜脈取血，測空腹血糖，以空腹血糖≥16.7 mmol·L-1且持續(xù)1周確定為模型復(fù)制成功［7］。DM組大鼠給予正常飲食，EtOH+DM組待大鼠糖尿病模型造模成功后給予體積分數(shù)為0.025的乙醇適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，體積分數(shù)為0.05的乙醇持續(xù)喂養(yǎng)至8周。正常對照組大鼠常規(guī)飲食，不做任何處理，持續(xù)喂養(yǎng)8周。

1.2.2 空腹血糖及糖化血紅蛋白（HbA1c）檢測 8周后，清晨稱量大鼠空腹體重，尾靜脈取血，測定空腹血糖（FBG）水平，水合氯醛麻醉后頸總動脈取血1.5 ml，置于肝素抗凝管中，室溫靜置30 min，離心4 000 r·min-1，5 min，分離紅細胞，測定糖化血紅蛋白（HbA1c）水平。

1.2.3 血清生化指標測定肝功能 麻醉狀態(tài)下，頸總動脈取血3 ml至肝素抗凝管中，送至蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院檢驗科，檢測血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶（AST）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（ALT）的含量。

1.2.4 肝組織病理學(xué)檢查 大鼠處死后，速取肝臟并稱重，計算肝重指數(shù)（肝臟重量／體重）。于-80℃冰箱保存?zhèn)溆?；取部分肝臟，用質(zhì)量分數(shù)為0.04的多聚甲醛固定，石蠟包埋，HE染色，光鏡下觀察肝臟組織病理變化。

1.2.5 Western blot檢測肝臟組織ALDH2、JNK蛋白表達 取0.1 g肝臟組織勻漿，4℃離心（12 000 r·min-1，30 min），BCA法測定蛋白濃度，以總蛋白0.08 mg上樣，使蛋白變性，配膠，電泳后轉(zhuǎn)PVDF膜，脫脂奶粉封閉 2 h，TBS稀釋一抗 ALDH2（1∶500）、JNK、p-JNK（1∶1 000），加一抗，水浴搖床，4℃過夜。次日水浴搖床，TBS洗膜4次。ECL試劑顯色，曝光成像。凝膠成像系統(tǒng)測量條帶的灰度值，計算 ALDH2／β-actin，p-JNK／β-actin、JNK／βactin、p-JNK／JNK蛋白表達的相對量。

1.2.6 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS15.0統(tǒng)計軟件，實驗結(jié)果以表示，各組間采用One-way ANOVA進行統(tǒng)計學(xué)分析。

2 結(jié)果

2．1 各組大鼠空腹血糖（FBG）、糖化血紅蛋白（HbA1c）水平、肝重指數(shù)（肝臟重量／體重）的變化與Con組大鼠相比，DM組和EtOH+DM組大鼠的FBG、HbA1c水平、肝重指數(shù)明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；與DM組相比，EtOH+DM組的FBG、HbA1c水平、肝重指數(shù)明顯降低（P＜0.05～0.01），見 Tab 1。

Tab 1 Changes of fasting blood glucose（FBG）and glycosylatedhemoglobin（HbA1c）levels and LW／BW in different groups

2.2 各組大鼠肝功能的測定 與Con組比較，DM組和EtOH+DM組大鼠血清ALT和AST含量明顯升高（P＜0.05～0.01）；與DM組比較，EtOH+DM組大鼠血清ALT、AST含量降低（P＜0.01），見 Tab 2。

Tab 2 Changes of serum ALT and AST levels in different groups

2.3 各組大鼠肝臟病理形態(tài)學(xué)改變 HE染色結(jié)果顯示：Con組大鼠肝組織中肝細胞形態(tài)正常，肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝細胞索整齊排列，偶見少量炎癥細胞浸潤。DM組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)異常，肝細胞邊界不清，細胞腫脹，細胞索排列紊亂，假小葉形成，間質(zhì)內(nèi)可見較明顯的炎性細胞浸潤。EtOH+DM組與DM組相比細胞形態(tài)尚正常，肝細胞腫脹、肝小葉的破壞和假小葉的形成均有明顯的改善（Fig 1、2）

2．4 W estern blot檢測肝臟組織 ALDH2、JNK、p-JNK蛋白表達 DM組大鼠肝臟ALDH2蛋白表達水平明顯低于Con組（P＜0.01），EtOH+DM組大鼠肝臟 ALDH2蛋白表達明顯高于 DM組（P＜0.01），見 Fig 3。

與Con組相比，DM組大鼠肝臟p-JNK、JNK蛋白的表達均明顯增高，p-JNK／JNK比值增加（P＜0.01）；與 DM組相比，EtOH+DM組大鼠肝臟 p-JNK、JNK蛋白的表達均明顯降低，p-JNK／JNK比值下降（P＜0.01），見 Fig 4。

Fig 1 Pathology of liver of diabetic rats in different groups（×100） A：Con；B：DM；C：EtOH+DM

Fig 2 Pathology of liver of diabetic rats in different groups（×400） A：Con；B：DM；C：EtOH+DM

Fig 3 Representative W estern blot（A）and quantitative analysis of ALDH2／β-actin protein expression（B）in liver of diabetic rats**P＜0．01 vs Con；##P＜0．01 vs DM.

Fig RepresentativeW estern blot（A）and quantitative analysis of the ratio ofpan／β-actin（D）protein expression in liver of diabetic rats**P＜0．01 vs Con；##P＜0．01 vs DM.

3 討論

糖尿病作為一種慢性進行性內(nèi)分泌及代謝性病，主要表現(xiàn)為其復(fù)雜的并發(fā)癥對身體健康造成嚴重的危害。糖尿病肝損傷是其慢性并發(fā)癥之一，同時，在疾病的發(fā)展過程中慢性肝損傷也可以影響糖代謝，加重糖尿病病情，形成惡性循環(huán)。糖尿病肝病后期會增加肝硬化、肝癌的發(fā)生率。因此，探討糖尿病肝病發(fā)生機制，研究其可能的治療措施，對于改善糖尿病患者的預(yù)后具有重要意義。

臨床了解肝功能主要是通過檢測血清中ALT、AST、ALP、血清總膽紅素（TB）等的水平。正常細胞由于細胞膜的包裹，ALT和AST不會釋入血中。肝細胞受到損害后，細胞變性、壞死，細胞膜破碎或細胞膜的通透性增加，肝細胞中所含的ALT和AST就會被釋放到血液中，使血中ALT、AST水平增加。本實驗觀察到DM大鼠空腹血糖和糖化血紅蛋白水平均上升，血清ALT、AST水平增高，提示糖尿病誘發(fā)了肝功能損傷。

ALDH2是重要的內(nèi)保護因子，與生物氧化關(guān)系密切。Ohta等［8］的研究發(fā)現(xiàn)，ALDH2活性缺失型PC12細胞更容易受到脂質(zhì)過氧化的損傷，且細胞存活率低。俞佳艷等［9］也觀察到ALDH2基因高表達可有效地抑制急性心肌梗死后心衰小鼠心肌細胞的凋亡。有文獻報道，糖尿病引起代謝紊亂，會使糖原在肝組織堆積，游離脂肪酸過多進入肝組織，導(dǎo)致肝微血管病理性損傷，進一步可能會出現(xiàn)脂肪肝或肝硬化等一系列的肝損傷［10］。本研究中觀察到糖尿病大鼠肝功能降低，HE染色顯示小葉結(jié)構(gòu)異常，肝細胞邊界不清，腫脹，假小葉形成，可見明顯的炎性細胞浸潤，同時，肝臟ALDH2表達降低，提示糖尿病引起的肝臟損傷可能與肝臟ALDH2的表達降低有關(guān)。給予ALDH2激動劑低劑量乙醇干預(yù)后，血清中ALT、AST濃度降低，病理改變有所減輕，肝臟ALDH2的表達增加，提示激動ALDH2可改善糖尿病大鼠肝功能，對肝臟有保護作用。

JNK屬于促分裂原活化蛋白激酶（mitogen-activatedprotein kinases，MAPK）一族。JNK可以被生長因子、細胞因子和細胞應(yīng)激等激活。糖尿病代謝紊亂導(dǎo)致的高血糖、高血脂使細胞內(nèi)活性氧生成增加或清除不足，機體出現(xiàn)氧化應(yīng)激，進而激活JNK通路，使JNK磷酸化為p-JNK。Kohl等［11］在實驗中觀察到：糖尿病大鼠肝臟損傷的過程中JNK蛋白表達明顯增加。本實驗中我們觀察到：與對照組相比，糖尿病組大鼠肝組織 ALDH2表達降低的同時，p-JNK、JNK蛋白的表達均明顯增高，p-JNK／JNK比值增加，提示糖尿病引起肝臟ALDH2的降低可能導(dǎo)致氧化應(yīng)激加重，使得JNK和p-JNK表達增加，加重糖尿病肝臟損傷；與糖尿病組相比，乙醇干預(yù)后大鼠肝臟ALDH2表達增加，p-JNK、JNK蛋白的表達均明顯降低，p-JNK／JNK比值下降，提示激動ALDH2后可能通過降低JNK的活性，進而降低對糖尿病大鼠肝臟的損傷。

Moon等［12］對暴露在四氯化碳中的大鼠研究發(fā)現(xiàn)，四氯化碳可以通過活化JNK，進而抑制ALDH2的活性，并最終導(dǎo)致肝臟的嚴重損傷。其研究說明JNK與ALDH2之間確實存在一定關(guān)系，從另一角度也間接支持了本文觀點。

當(dāng)然，高濃度乙醇對肝臟的損傷作用更為大家熟識，報道甚多。邱萍等［13］研究指出，長期大量飲酒可增加體內(nèi)ROS含量，從而加重肝臟氧化應(yīng)激，并發(fā)生炎癥、壞死和纖維化等病理改變。王喜軍等［14］使用體積分數(shù)為0.5的乙醇誘導(dǎo)大鼠肝損傷模型。而本實驗中我們采用體積分數(shù)為0.025和0.05的低劑量乙醇，結(jié)果顯示，給予低劑量乙醇干預(yù)，糖尿病大鼠肝功能有所恢復(fù)，提示該濃度乙醇未加重肝臟損傷，反而起到保護作用。同時觀察到肝臟ALDH2表達增高，p-JNK／JNK比值下降，提示低劑量乙醇作為ALDH2的激動劑對肝臟有一定的保護作用，后期實驗中我們將選用利于臨床應(yīng)用的ALDH2特異性激動劑并進一步觀察其保護作用，為臨床糖尿病引起的肝損傷提供新的治療手段。

因此，我們得出結(jié)論，ALDH2蛋白對糖尿病大鼠肝臟有保護作用；激動ALDH2的表達可能通過抑制JNK通路的活化，減輕肝臟損傷。ALDH2如何調(diào)控JNK通路發(fā)揮保護作用，有待進一步研究。

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