氧誘導(dǎo)新生小鼠視網(wǎng)膜病變中血管新生和氧應(yīng)激相關(guān)基因表達(dá)的變化

余增洋，龔陳媛，張國慶，季莉莉

（1.上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥研究所中藥標(biāo)準(zhǔn)化教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中藥新資源與質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)綜合評價國家中醫(yī)藥管理局重點(diǎn)研究室，上海市復(fù)方中藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 201203；2.上海兒童醫(yī)學(xué)中心，上海 200127）

隨著新生兒護(hù)理?xiàng)l件的改善，早產(chǎn)兒存活率明顯增加，然而這也導(dǎo)致了較高的早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變（retinopathy of prematurity，ROP）的發(fā)病率。目前，ROP已成為嚴(yán)重威脅新生兒視力健康的一種疾病，由Smith等［1］建立的氧誘導(dǎo)新生小鼠視網(wǎng)膜病變模型（oxygen-induced retinopathy，OIR）成功復(fù)制了ROP的特點(diǎn)，在ROP研究中得到廣泛應(yīng)用。

OIR病理機(jī)制目前尚未明確，有諸多細(xì)胞因子和通路可能都參與其病變過程。目前認(rèn)為，缺血、缺氧誘導(dǎo)視網(wǎng)膜血管異常增生是導(dǎo)致ROP的根本原因［2-4］。由缺氧誘導(dǎo)因子（hypoxia-inducible factor-1，HIF-1）介導(dǎo)表達(dá)的血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是公認(rèn)的具有明顯促進(jìn)微血管新生功能的生長因子［5］；血小板衍生生長因子 （platelet-derived growth factor，PDGF）也具有促進(jìn)微血管新生的功能［6-7］。然而，OIR過程中血管新生相關(guān)基因表達(dá)的變化缺乏較為系統(tǒng)的研究，同時OIR過程中VEGF及PDGF受體變化的研究相對較少。血管新生過程還涉及血管基底膜和細(xì)胞外基質(zhì)的崩解，已知基質(zhì)金屬蛋白酶（matrixmetalloproteinases，MMPs）在其中發(fā)揮重要作用［8］，本文中我們選取了MMPs的兩個重要成員MMP2和MMP9，分別檢測了其在OIR過程中的基因表達(dá)變化。此外，有研究發(fā)現(xiàn)缺氧誘導(dǎo)產(chǎn)生的氧化應(yīng)激也參與ROP的發(fā)展過程中，高氧-復(fù)氧過程引起視網(wǎng)膜相對缺氧，增加ROS的產(chǎn)生，引起視網(wǎng)膜血管氧化損傷［9-10］。Nrf2是參與調(diào)控抵抗氧化應(yīng)激的主要核轉(zhuǎn)錄因子。因此本論文在建立的新生小鼠OIR模型基礎(chǔ)上，運(yùn)用Real-time PCR技術(shù)觀察了促血管新生相關(guān)的VEGF及其受體、PDGF及其受體，以及在降解細(xì)胞外基質(zhì)起作用的MMP家族相關(guān)基因的表達(dá)情況；同時還檢測了氧應(yīng)激相關(guān)Nrf2及其調(diào)控的GCLC、GCLM基因的表達(dá)情況。

1 材料與試劑

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 SPF級C57BL小鼠，♀♂各5只，8周齡，購自中國科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動物中心［合格證號：SCXK（滬）2012-0002］。飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心，♀♂隨機(jī)組合為5對進(jìn)行繁殖，溫度（22±1）℃，濕度（55±5）%，飼料與水消毒后自由攝取，12 h光暗循環(huán)。實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格按照國家和上海中醫(yī)藥大學(xué)動物中心動物使用管理?xiàng)l例進(jìn)行。

1.2 試劑 多聚甲醛、Triton X-100、Gelatin均購自國藥試劑；CD31抗體、FITC conjugated anti-Rat IgG均購自 BD（Franklin Lakes，NJ）；PrimeScript RTMaster Mix Perfect Real Time、SYBR Premix Ex Taq（Tli RNaseH Plus）（TaKaRa）；用于 Real-Time PCR特異性引物序列見Tab 1，購自上海捷瑞公司。

Tab 1 Sequences of primers used for real-time RT-PCR

1.3 儀器 DYC-I型常壓動物實(shí)驗(yàn)艙（中國船舶重工集團(tuán)公司第七○一研究所）；冷凍層析柜（北京德天佑公司）；水平搖床（基因公司）；解剖顯微鏡、倒置熒光顯微鏡（Olympus）、移液器、渦旋振蕩儀、低溫離心機(jī)（Eppendorf）；Real-Time PCR儀（ABIStepone Plus）。

2 方法

2．1 OIR模型建立 C57BL小鼠出生后d 7（P7），隨機(jī)分為正常組與缺氧組，每組10只。正常組小鼠飼養(yǎng)于正常氧環(huán)境中；缺氧組小鼠飼養(yǎng)于75.5%氧分壓氧艙中，高氧環(huán)境5 d后，即d 12返回至正常氧環(huán)境中，繼續(xù)飼養(yǎng)5 d，至17 d（P17）。

2.2 視網(wǎng)膜免疫熒光鋪片 取P17小鼠處死，摘取眼球，于4%多聚甲醛（in PBS）中4℃固定過夜，于解剖顯微鏡下，用虹膜剪沿角膜邊緣剪開，移除晶狀體和玻璃體，取出完整視網(wǎng)膜，PBS洗2～3次，Blocking Buffer（5%BSA，0.5%Trixton X-100 in PBS）封閉2 h，與 CD31抗體于4℃ 孵育2 d，Wash Buffer（0.5%Trixton X-100 in PBS）洗6次，與二抗避光孵育2 h，Wash Buffer洗6次，剪視網(wǎng)膜成花瓣?duì)?，平鋪于載玻片上，明膠（2 g·ml-1）固定并封片，于熒光顯微鏡下觀察并拍照。

2．3 Real-Time PCR檢測 P17小鼠脫頸椎法處死，摘取眼球，放置于 DEPC-treated Water中，于解剖顯微鏡下取出視網(wǎng)膜組織（若不立即進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，樣本組織存放于-80℃）。運(yùn)用TRIzol試劑（Invitrogen），提取視網(wǎng)膜組織總mRNA，總mRNA溶解于RNase-free H2O中，1μg總 mRNA按照試劑盒（TaKaRa）方法逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，Real-Time PCR擴(kuò)增按照試劑盒（TaKaRa）方法，相對基因表達(dá)分析采用 2-ΔΔCt法。

2.4 數(shù)據(jù)分析 數(shù)據(jù)結(jié)果均用表示。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPASS 16.0軟件統(tǒng)計，兩兩比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。

3 結(jié)果

3.1 視網(wǎng)膜血管免疫熒光鋪片 結(jié)果顯示，P17正常組小鼠視網(wǎng)膜血管網(wǎng)以視盤為中心呈放射狀向周圍排列，血管密度分布均勻，走形自然，無血管閉塞（Fig 1 A、C、E）。OIR組小鼠視網(wǎng)膜視盤周圍呈現(xiàn)大量無灌注區(qū)（Fig 1B）；在無灌注區(qū)沿視網(wǎng)膜放射狀動脈，箭頭指示處可見明顯新生血管芽（Fig 1D）；視網(wǎng)膜周邊區(qū)域血管密度明顯增加，血管迂曲、擴(kuò)張、變形、不規(guī)則，并可見微血管瘤（Fig 1F）。

3．2 VEGF及其受體的基因表達(dá)情況 結(jié)果顯示，與正常組相比，OIR小鼠視網(wǎng)膜組織中 VEGFA、VEGFD的基因表達(dá)上調(diào)，VEGFB、VEGFC的基因表達(dá)未見變化；其相應(yīng)受體家族中，VEGFR1、VEGFR2的基因表達(dá)上調(diào)，VEGFR3表達(dá)未見變化。見Fig 2。

Fig 1 CD31 immunofluorescence staining of the retinasA：Whole retinas of control，B：Whole retinas of OIR model（4×magnification）；C：The central region in retinas of control；D：The central region in retinas of OIR model.（Arrows indicate the new vessels）（10×magnification）；E：The peripheral region in retinas of control；F：The peripheral region in retinas of OIRmodel（10×magnification）.

Fig 2 Retinal gene expression of VEGFs and VEGFRs in control and OIR m ice*P＜0.05，**P＜0.01 vs control.

3．3 PDGFs及其受體基因表達(dá)情況 PDGF是另一個重要的促進(jìn)血管新生因子家族，我們的結(jié)果顯示，與正常組相比，OIR小鼠視網(wǎng)膜組織PDGFA、PDGFB及其受體PDGFRa、PDGFRb的基因表達(dá)均呈現(xiàn)上調(diào)，尤其是PDGFB上調(diào)更為明顯，顯示出PDGFB可能在OIR模型中發(fā)揮促進(jìn)血管新生的重要作用。見Fig 3。

Fig 3 Retinal gene expression of PDGFs and PDGFRs in control and OIR m ic*P＜0．05，**P＜0．01 vs control.

3．4 MMP2與MMP9基因表達(dá)情況 MMPs調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)降解，以促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移和新生血管形成。我們的結(jié)果顯示，與正常組相比，OIR小鼠視網(wǎng)膜組織MMP2基因表達(dá)上調(diào)，但MMP9基因表達(dá)下調(diào)。說明MMP2可能在OIR小鼠視網(wǎng)膜降解血管基底膜，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞遷移和新生血管形成方面起重要作用。見Fig 4。

Fig 4 Retinal gene expression of MMP2 and MMP9 in control and OIR m ice*P＜0．05，**P＜0．01 vs control.

3.5 抗氧化相關(guān)基因表達(dá)情況 我們檢測了在氧應(yīng)激中具有重要調(diào)控作用的核轉(zhuǎn)錄因子Nrf2及其所調(diào)控的下游基因GCLC和GCLM的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，OIR小鼠視網(wǎng)膜組織中 Nrf2、GCLC及GCLM的基因表達(dá)均下調(diào)。見Fig 5。

Fig 5 Retinal gene expression of Nrf2，GCLC andGCLM in control and OIR m ice**P＜0．01 vs control.

4 討論

ROP已成為導(dǎo)致嬰兒失明的主要原因，占中等發(fā)達(dá)國家兒童致盲原因的6%-18%［11］，臨床上尚無理想的治療方法和藥物。我們采用由Smith等［1］所建立的方法，新生小鼠由于視網(wǎng)膜血管床未發(fā)育完全，放入高氧環(huán)境中血管停止生長，再返回正常氧環(huán)境后，相對缺氧狀態(tài)誘導(dǎo)視網(wǎng)膜血管異常新生。在本實(shí)驗(yàn)中，我們成功制備了OIR模型，為治療ROP的藥物篩選建立了平臺。并對參與引起微血管新生的一些關(guān)鍵信號分子的基因表達(dá)情況進(jìn)行了檢測，這些為我們后期藥物靶向治療及相應(yīng)藥理研究奠定了前期基礎(chǔ)。

VEGF家族包括 VEGFA、VEGFB、VEGFC、VEGFD；VEGF受體包括 VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3；VEGFs通過與VEGFRs結(jié)合發(fā)揮作用。VEGFA即一般所指的VEGF，是機(jī)體內(nèi)最重要的促血管生成因子，可與VEGFR1及VEGFR2結(jié)合?，F(xiàn)在認(rèn)為，VEGFA主要通過與VEGFR2結(jié)合來發(fā)揮促血管新生的作用；相反，VEGFR1與VEGFA結(jié)合后可抑制VEGFR2對VEGFA的激活作用［12］。VEGFR1的作用可能不是表現(xiàn)在直接促進(jìn)血管新生，而是通過特異性促進(jìn)血管組織釋放生長因子，間接促進(jìn)血管新生［13］。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)在OIR模型中視網(wǎng)膜中VEGFA和其受體VEGFR1、VEGFR2的表達(dá)均明顯增加，說明它們在ROP病變過程中具有一定的作用。VEGFD是重要的促進(jìn)淋巴內(nèi)皮細(xì)胞增殖的生長因子，它主要和淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞上VEGFR3結(jié)合發(fā)揮作用［14-15］。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，VEGFD表達(dá)有所增加，但是其受體的表達(dá)并未見明顯增加，因此VEGFD在ROP中的作用有待進(jìn)一步深入研究。有研究表明，缺氧刺激下，VEGFB、VEGFC基因表達(dá)并未增加［16］，我們的結(jié)果印證了這一點(diǎn)。

血小板衍生生長因子家族PDGFs同VEGF有較大同源性，是另一種重要的促血管生成因子［6-7］，主要包括 PDGFA和 PDGFB，其受體是 PDGFRa、PDGFRb。我們的結(jié)果顯示，缺氧刺激下，PDGFA、PDGFB、PDGFRa、PDGFRb基因表達(dá)均上調(diào)，說明PDGFA和PDGFB在ROP病變中起重要作用。

MMPs在調(diào)節(jié)視網(wǎng)膜血管細(xì)胞外基質(zhì)降解，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞遷移中起重要作用［8］。我們的結(jié)果顯示，相對缺氧刺激下，MMP2基因表達(dá)上調(diào)，而MMP9基因表達(dá)下調(diào)。體外實(shí)驗(yàn)上，有報道顯示，猴視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞RF／6A在缺氧刺激下，MMP2基因表達(dá)上調(diào)，而MMP9基因表達(dá)下調(diào)，這與我們體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果一致［17］。說明缺氧刺激通過上調(diào)MMP2而非MMP9表達(dá)，進(jìn)而發(fā)揮降解細(xì)胞外基質(zhì)的作用。

已有研究發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激在缺氧誘導(dǎo)視網(wǎng)膜微血管增殖性病變中起重要作用［9-10］。核轉(zhuǎn)錄因子Nrf2是細(xì)胞防御過氧化應(yīng)激的重要調(diào)節(jié)因子。Nrf2結(jié)合到基因抗氧化應(yīng)激反應(yīng)元件（antioxidant responsive element，ARE）的啟動子序列上，可啟動一系列抗氧化基因的表達(dá)，其中主要包括 GCLC，GCLM。我們的結(jié)果顯示，與正常組相比，OIR小鼠視網(wǎng)膜組織中Nrf2、GCLC、GCLM的基因表達(dá)均下調(diào)。說明缺氧刺激下，OIR小鼠視網(wǎng)膜組織抗氧化能力下調(diào)，提示氧化應(yīng)激參與了缺氧誘導(dǎo)小鼠視網(wǎng)膜病變的過程。

綜上所述，正常機(jī)制狀態(tài)下，視網(wǎng)膜組織內(nèi)部維持動態(tài)的平衡，包括促血管生成與抑制血管生成之間、氧化應(yīng)激的產(chǎn)生與抵抗氧化應(yīng)激之間等等。通過我們建立的OIR模型的研究，我們發(fā)現(xiàn)當(dāng)受到外界缺氧刺激，打破了視網(wǎng)膜組織內(nèi)部這些平衡，就會導(dǎo)致其朝向促進(jìn)血管新生、降低抵抗氧應(yīng)激能力的方面發(fā)展。

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