Tuftsin衍生物TP影響腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞 M IP-1α分子表達(dá)

安映紅，賈 娜，李琳娜，韓 蘇，楊德宣，袁守軍

（1.空軍總醫(yī)院臨床檢驗中心生化室，北京 100142；2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所藥理毒理，北京 100850）；3.南開大學(xué)藥學(xué)院，天津 300071）

Tuftsin是機(jī)體脾臟產(chǎn)生的一段生理活性肽［1］，由蘇-賴-脯-精氨酸（Thr-Kys-Pro-Arg，TKPR）組成的一級結(jié)構(gòu)，具有促吞噬活性，所以命名為促吞噬肽［2］。早期研究表明，Tuftsin具有一定的抗腫瘤活性［3］。然而，由于其較短的肽鏈及體內(nèi)半衰期使得其至今難以成藥并應(yīng)用于臨床。T肽（T peptide，TP）是本課題組和制藥公司共同研發(fā)的創(chuàng)新抗癌藥［4-5］，結(jié)構(gòu)為由賴氨酸將4個Tuftsin樣結(jié)構(gòu)連接在一起組成。藥物代謝動力學(xué)研究表明，TP具有較長的體內(nèi)半衰期［5］。前期藥效評價結(jié)果證明，TP對術(shù)后殘瘤具有明顯的抗癌活性［6-8］。對TP作用機(jī)制的研究有助于深刻理解TP的術(shù)后抗癌過程。腫瘤間質(zhì)中浸潤的巨噬細(xì)胞即腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（tumor associated macrophages，TAMs）是腫瘤組織中浸潤的一群重要免疫細(xì)胞，在腫瘤微環(huán)境的調(diào)控下TAMs可以轉(zhuǎn)換表型，演變?yōu)橐种颇[瘤生長的M1型和促進(jìn)腫瘤進(jìn)程的M2型［9-10］。前期研究已經(jīng)證實TP能刺激巨噬細(xì)胞并轉(zhuǎn)化其在腫瘤微環(huán)境中的細(xì)胞表型發(fā)揮抗癌作用。巨噬細(xì)胞分泌產(chǎn)生巨噬細(xì)胞炎性蛋白-1α（macrophage inflammatory protein，MIP-1α），MIP-1α又名 CCL3，是趨化因子配體 3，參與炎癥及吞噬細(xì)胞的活化、趨化，參與組織修復(fù)，腫瘤組織中常能檢測到其表達(dá)增加。有文獻(xiàn)報道［11］，MIP-1α可促進(jìn)瘤細(xì)胞生長，增值，存活，在人軟骨肉瘤中MIP-1α在刺激劑的作用下還可誘導(dǎo)細(xì)胞遷移［12］，是抗腫瘤研究的一個重要靶點。因此，TP既然能通過巨噬細(xì)胞發(fā)揮抗癌活性，那么也有可能對MIP-1α有調(diào)節(jié)作用，本研究旨在探討MIP-1α是否是TP抗癌過程中的一個重要靶點，從而為TP抗癌作用機(jī)制提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 昆明小鼠，♀，4～6周齡，體質(zhì)量18～22 g，購于軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動物中心，并在軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動物中心飼養(yǎng)，小鼠食用專用飼料，自由飲水，每日光照12 h，實驗室溫度保持在25℃左右，相對濕度約40%-70%。小鼠巨噬細(xì)胞Ana-1細(xì)胞株由本實驗研究室傳代保存。TP為白色凍干粉末，純度＞98%，由北京中天康泰生物科技有限公司提供，使用前生理鹽水稀釋。抗小鼠MIP-1α單克隆抗體購自武漢博士德公司。反轉(zhuǎn)錄（RT）反應(yīng)試劑盒購買于美國Promega公司。Ⅳ型膠原酶購于美國 In-vitrogen公司，透明質(zhì)酸酶，DNA酶Ⅰ購于華美生物工程有限公司。配制消化液：1 g·L-1Ⅳ型膠原酶，1%透明質(zhì)酸酶和0.25%DNA酶Ⅰ。

1．2 TAM s細(xì)胞分離 建立小鼠S180術(shù)后殘瘤模型，待腫瘤生長至500～800 mm3時，無菌分離新鮮殘瘤組織，生理鹽水清洗3～5次，剪成1～3 mm3的小塊。37℃用消化液消化腫瘤組織塊3 h，制備成單細(xì)胞懸液，PBS洗滌2～3次，接種到培養(yǎng)皿中，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱2 h。然后將未貼壁細(xì)胞棄掉，PBS洗滌2～3次，貼壁細(xì)胞即為腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞［14］。

1．3 RT-PCR實驗 收集Ana-1、TAM或不同濃度TP處理的Ana-1或TAM約500萬個細(xì)胞，提取細(xì)胞總RNA，測定RNA含量和純度。20μl的反轉(zhuǎn)錄體系為：1μg RNA加1μl OligodT，配相應(yīng)體積的無RNA酶水，70℃變性5 min后置于4℃，然后加入5×Prime Buffer 4μl，MgCl22.4μl，dNTP（2.5 mmol·L-1）4μl，Rnasin（20U）0.5μl，RTase 1μl，3.1μl無RNA酶水。反轉(zhuǎn)錄條件：37℃反應(yīng)15 min，85℃加熱5min滅活反轉(zhuǎn)錄酶，然后置于4℃。反轉(zhuǎn)錄的cDNA產(chǎn)物進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件為：94℃變性5 min；然后經(jīng)94℃變性30 s，55℃退火30秒，72℃延伸1min，進(jìn)行30個循環(huán)，再72℃延伸5min。1%瓊脂糖電泳檢測PCR產(chǎn)物。引物序列由美國Invitrogen公司合成。β-actin上、下游引物序列為5′-TCTACAATGAGCTGCGTGTG-3′和 5′-GGTCAGGATCTTCATGAGGT-3′；MIP-1α上、下游引物序列為 5′-TCACCTGCTCAACATCATG-3′和 5′-TCAGGCATTC AGTTCCAGCT-3′。

1.4 小鼠異種移植瘤雙瘤手術(shù)模型的建立 在小鼠左、右腋下均接種小鼠腹腔抽取的S180肉瘤腫瘤細(xì)胞，待小鼠皮下腫瘤生長至約250 mm3時，將其中一側(cè)手術(shù)切除部分腫瘤組織，建立術(shù)后殘瘤模型［4］，左側(cè)腋下腫瘤不作處理。按照殘瘤瘤體積大小分組：對照組，陽性藥環(huán)磷酰胺（CTX）組及TP 8 mg·kg-1組，并于術(shù)后次日開始給藥，CTX劑量為30 mg·kg-1，給藥1次；TP隔天1次，共給藥4次。實驗結(jié)束時分離腫瘤組織。

1．5 免疫組化檢測術(shù)后殘瘤組織中M IP-1α的蛋白表達(dá) 手術(shù)剝離的腫瘤組織，用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋制成病理切片，免疫組化染色檢測MIP-1α的表達(dá)。

2 結(jié)果

2．1 Ana-1細(xì)胞和TAM s的M IP-1α的mRNA表達(dá)比較 將對數(shù)生長期的Ana-1細(xì)胞和原代分離的TAMs提取細(xì)胞總RNA，檢測并對比 MIP-1αmRNA的表達(dá)差別。實驗結(jié)果表明兩種來源的細(xì)胞MIP-1αmRNA表達(dá)量基本一致，差別沒有統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），如Fig 1所示。結(jié)果提示，無論巨噬細(xì)胞系，還是原代的巨噬細(xì)胞均能高表達(dá)MIP-1α。

Fig 1 mRNA expression of M IP-1αin Ana-1 cells and TAM s

2．2 TP對Ana-1細(xì)胞M IP-1αm RNA的影響不同濃度TP處理對數(shù)生長期的Ana-1細(xì)胞72 h后，提取細(xì)胞總 RNA，檢測 MIP-1αmRNA的表達(dá)。如Fig 2所示，與空白對照組相比，3個濃度（0.2、2和20μmol·L-1）的 TP對 Ana-1細(xì)胞的 MIP-1αmRNA表達(dá)無明顯影響，組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義，P＞0.05?？梢奣P對建系的巨噬細(xì)胞系的MIP-1α的表達(dá)無明顯影響。

Fig 2 mRNA expression of M IP-1αin Ana-1 cells treated w ith TP

2．3 TP對TAM s的M IP-1αm RNA的影響 不同濃度TP處理原代分離的TAMs 72 h后，提取細(xì)胞總RNA，檢測MIP-1αmRNA的表達(dá)。如Fig 3所示，與空白對照組相比，TP明顯降低 TAMs的 MIP-1αmRNA的表達(dá)，3個濃度（0.2、2和 20μmol·L-1）與空白組相比差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，P＜0.01，且呈劑量依賴性?？梢妼τ谀[瘤組織中的巨噬細(xì)胞，TP有其作用的細(xì)胞位點，并能引起巨噬細(xì)胞生物學(xué)的改變，從而導(dǎo)致一些細(xì)胞因子表達(dá)發(fā)生變化。

Fig 3 m RNA expression of M IP-1αin TAM s treated w ith TP**P＜0.01 vs Control.

2．4 TP對腫瘤組織中M IP-1α蛋白的表達(dá)影響為進(jìn)一步證實上述結(jié)果，本研究進(jìn)行了體內(nèi)試驗以驗證TP是否影響MIP-1α蛋白的表達(dá)。首先方法中所描述的建立小鼠S180肉瘤細(xì)胞雙瘤模型，并于腫瘤體積生長至約250 mm3時，在其中一側(cè)建立術(shù)后殘瘤模型后，然后給予CTX和TP。實驗結(jié)束時手術(shù)瘤和未手術(shù)瘤組織均做免疫組化染色，檢測MIP-1α蛋白在各個組的表達(dá)情況。實驗結(jié)果如Fig 4，TP處理組的荷瘤小鼠的腫瘤組織MIP-1α與對照組相比表達(dá)明顯降低，接近于陽性藥環(huán)磷酰胺組；而且對于同一只小鼠的手術(shù)后的殘瘤組織與未手術(shù)的瘤組織，TP均能降低MIP-1α蛋白的表達(dá)。

3 討論

TAMs可被調(diào)控成M1或M2表型，M1型巨噬細(xì)胞呈現(xiàn)強(qiáng)的抗原呈遞能力，分泌IL-12／23，誘導(dǎo)Ⅰ型免疫應(yīng)答，產(chǎn)生NO、活性氧等，具有對腫瘤細(xì)胞的殺傷能力；M2型巨噬細(xì)胞釋放免疫抑制因子，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖，演進(jìn)以及輔助腫瘤細(xì)胞遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移［13］。而腫瘤微環(huán)境中浸潤的巨噬細(xì)胞大多數(shù)為M2型［9］。因而，調(diào)控腫瘤微環(huán)境中的 TAMs，誘導(dǎo)其成為M1型或者使其不被誘導(dǎo)活化為M2型成為研究者熱衷的課題。前期實驗研究已證實調(diào)控巨噬細(xì)胞是TP發(fā)揮抗癌作用的機(jī)制之一，TP可調(diào)控TAMs，增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬、細(xì)胞毒功能，促使TAMs分泌 Th1相關(guān)的促炎因子（TNF-α、IL-12、NO、CXCL9、CXCL11等），使其向 M1型極化；還可逆轉(zhuǎn)M2巨噬細(xì)胞的表型，增加Th1相關(guān)的炎性細(xì)胞因子表達(dá)［14］。因此，研究TAMs能更深入理解TP抗癌機(jī)制。巨噬細(xì)胞可產(chǎn)生MIP-1α，其屬于趨化因子家族，參與細(xì)胞黏附和遷移，在腫瘤發(fā)展過程中具有重要作用。TP能夠降低腫瘤組織中巨噬細(xì)胞MIP-1α的表達(dá)，并呈劑量依賴性，說明MIP-1α有可能是TP抗癌作用機(jī)制的又一新靶點，更加深入的研究有助于對TP體內(nèi)抗癌機(jī)制的深刻理解。

Fig 4 M IP-1αexpression in tumor tissues

目前，外科手術(shù)是實體癌患者的首選治療方式，但是手術(shù)只能最大限度的降低腫瘤負(fù)荷，完全消除腫瘤細(xì)胞的可能性較?。?5］，預(yù)防手術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)是臨床腫瘤治療的關(guān)鍵問題。小鼠術(shù)后殘瘤模型正是在此臨床背景下建立的［4］。殘瘤模型不僅減輕了腫瘤負(fù)荷，而且打破了腫瘤微環(huán)境的平衡［16］，打開了腫瘤深度免疫抑制區(qū)，使得免疫藥物、免疫細(xì)胞或免疫因子可以突破腫瘤組織的免疫抑制屏障，從而發(fā)揮抗腫瘤作用［4］。小鼠的雙瘤模型是在小鼠術(shù)后殘瘤模型的基礎(chǔ)上建立的。雙瘤模型既包括了術(shù)后殘余腫瘤組織，也包括了未手術(shù)瘤組織（相當(dāng)于模擬了臨床實際中遠(yuǎn)端未發(fā)覺的微小瘤灶）［4］。利用雙瘤模型可以同時檢測到在同一生物個體中手術(shù)過的腫瘤組織和未手術(shù)的腫瘤組織的特點。本實驗中使用雙瘤模型對同一只小鼠給予TP進(jìn)行術(shù)后治療，比較未手術(shù)瘤和手術(shù)瘤的腫瘤組織MIP-1α蛋白的表達(dá)情況，能更加全面完整的說明TP對腫瘤組織中MIP-1α的表達(dá)影響。

探討藥物藥效的體外試驗，常使用細(xì)胞系作為藥物作用的對象，用以初步判定藥物作用的效應(yīng)、方式、環(huán)節(jié)等；是體內(nèi)試驗的前期預(yù)測試，可以節(jié)約實驗成本，避免不必要的浪費(fèi)；在藥效學(xué)研究中也是慣用的操作流程，尤其是在腫瘤藥效學(xué)研究中可以利用現(xiàn)成的腫瘤細(xì)胞系去很好的判定一些細(xì)胞毒類藥物的藥效。然而建系的細(xì)胞系由于反復(fù)的多次傳代或者生長環(huán)境的改變，細(xì)胞本身的一些生物學(xué)特點與原代細(xì)胞相比可能已發(fā)生改變，對于一些刺激細(xì)胞活性或作用于細(xì)胞膜表面受體的藥物，如本文研究中的Tuftsin或TP，直接作用于細(xì)胞系就可能達(dá)不到預(yù)期的結(jié)果。本研究中Ana-1細(xì)胞是建系的巨噬細(xì)胞系，TAMs是原代巨噬細(xì)胞，TP作用于Ana-1細(xì)胞并不能影響MIP-1α的表達(dá)，而對于TAMs，TP可明顯降低體內(nèi)、外TAMs的MIP-1αmRNA的表達(dá)。這些結(jié)果說明對于免疫增強(qiáng)劑TP，單純的體外細(xì)胞系試驗并不能反映其在體內(nèi)發(fā)生作用的真實情況，藥效學(xué)評價時，體外實驗的陰性研究結(jié)果需要慎重對待。TP在動物體內(nèi)的作用方式、環(huán)節(jié)較為復(fù)雜，涉及很多免疫調(diào)控，因此，關(guān)于TP抗癌機(jī)制還有待進(jìn)一步探索研究。

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