中華大蟾蜍胚后原始大腦皮層神經(jīng)元自發(fā)電活動的發(fā)育變化

彭 霞，鄭 妍，王 云，王 暢，梁傳成，王麗文

（1.沈陽師范大學 實驗教學中心，沈陽 110034；2.沈陽師范大學 化學與生命科學學院，沈陽 110034；3.遼寧中醫(yī)藥大學 附屬第二醫(yī)院，沈陽 110034）

中華蟾蜍（Bufogargarizans）隸屬于兩棲綱，無尾目，蟾蜍科，蟾蜍屬，在我國棲居廣泛，數(shù)量多，最為常見［1］，是生態(tài)環(huán)境的重要指示動物。目前對蟾蜍及近緣種端腦發(fā)育的研究多在形態(tài)學和組織學上［2－5］，有關(guān)其發(fā)育電活動的研究尚未見報道。筆者應(yīng)用微電極電生理學技術(shù)，對中華蟾蜍胚后6個典型時期端腦原始大腦皮層進行了電生理研究，探討中華蟾蜍胚后各階段端腦原始大腦皮層的發(fā)育特性，以期充實無尾兩棲動物神經(jīng)系統(tǒng)資料，為進一步的研究工作奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

實驗中華蟾蜍幼體（蝌蚪和變態(tài)期）采自遼寧省沈陽市郊區(qū)。亞成體和成體中華蟾蜍購自沈陽醫(yī)學院。以王昌對中華蟾蜍胚胎發(fā)育分期為標準［6］，選用鰓蓋完全愈合期、圓錘狀肢芽期、肛管退化期、變態(tài)完成期、亞成體期以及成體期6個典型時期。發(fā)育各期中華蟾蜍各5例。

1.2 自發(fā)放電的測定

應(yīng)用微電極電生理技術(shù)，對中華蟾蜍胚后端腦原始大腦皮層神經(jīng)元的自發(fā)放電活動進行在體胞外記錄。常規(guī)手術(shù)方法暴露不同發(fā)育時期蟾蜍的端腦并剝離硬腦膜。用微電極推進器（西北光學儀器廠，WF－2型）將尖端直徑小于1μm、內(nèi)充3moL KCl、阻抗5～20mΩ的玻璃微電極插入原始大腦皮層中。放電信號經(jīng)由高阻微電極放大器（成都儀器廠，WF－IB型）后進入信號采集處理系統(tǒng)（成都儀器廠，RM6240型），在計算機上觀察并記錄原始大腦皮層神經(jīng)元的電活動。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

實驗結(jié)果用Microsoft Excel和SPSS 16.0軟件統(tǒng)計分析并作圖，各組之間的差異性采用單因素方差分析（One Way ANOVA）和Tukey's多重比較，文中數(shù)據(jù)以平均值±標準差表示（mean±SD），P＜0.05即認為差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 胚后各階段原始大腦皮層神經(jīng)元的自發(fā)放電

實驗共記錄到5種自發(fā)放電類型，分別為單個放電、連續(xù)放電、簇狀放電、連續(xù)簇狀放電和不規(guī)則放電（圖1），在不同的發(fā)育時期各類型放電單位所占比例不同，見圖2（圖中1～6分別是鰓蓋完全愈合期、圓錘狀肢芽期、肛管退化期、變態(tài)完成期、亞成體期和成體期）。胚后發(fā)育的早期鰓蓋完全愈合期和圓錘狀肢芽期只有4種放電類型，沒有記錄到不規(guī)則放電。分別共記錄到40和36個放電單位，分別以簇狀放電和連續(xù)放電為主，為35%和50%。

胚后發(fā)育的后期，肛管退化期到成體均為5種放電類型，分別共記錄到43、49、46和44個放電單位，以簇狀和連續(xù)簇狀放電為主要放電類型。肛管退化期以簇狀放電為主，占34.88%；變態(tài)完成期則以簇狀和連續(xù)簇狀放電為主，分別是24.49%和26.53%。亞成體期以連續(xù)簇狀放電和不規(guī)則放電為主，分別為28.26%和41.3%；成體期以簇狀和連續(xù)簇狀放電為主，分別為22.72%和31.82%。

2.2 胚后各階段原始大腦皮層自發(fā)放電的電生理學特性

對中華蟾蜍胚后發(fā)育各階段原始大腦皮層的單個和連續(xù)放電幅度以及連續(xù)單個和連續(xù)簇狀放電頻率進行了統(tǒng)計分析，結(jié)果見圖3和圖4（圖中1～6分別是鰓蓋完全愈合期、圓錘狀肢芽期、肛管退化期、變態(tài)完成期、亞成體期和成體期；a、b、c、d表示差異顯著性，同一放電類型不同發(fā)育時期的比較）。圖3表明，單個放電振幅變化不大，僅肛管退化期存在減小，顯著差異（P＜0.05）；連續(xù)放電幅度在胚后發(fā)育的中期均高于早期和成體期，且差異顯著（P＜0.05）。圖3表明，兩種放電頻率均隨著發(fā)育時期而降低，但在亞成體期再次升高，且連續(xù)單個放電較連續(xù)簇狀放電變化顯著。

我們還觀察測量了每個放電單位的放電持續(xù)時間（表1），結(jié)果發(fā)現(xiàn)，單個放電的動作電位時程在變態(tài)期開始縮短，為早期的一半，且差異顯著（P＜0.05）；連續(xù)放電和簇狀放電的持續(xù)時間變化趨勢相似，隨著原始大腦皮層的發(fā)育，放電持續(xù)時間延長，但分別在亞成體期和變態(tài)期出現(xiàn)縮短后再次增加；連續(xù)簇狀放電在變態(tài)期和亞成體期明顯延長，不規(guī)則放電在成體期時間最長。

圖2 中華蟾蜍不同發(fā)育時期原始大腦皮層各放電類型的放電單位比較

圖3 中華蟾蜍不同發(fā)育時期原始大腦大腦皮層2種放電類型的放電幅度

圖4 華蟾蜍不同發(fā)育階段原始大腦大腦皮層2種放電類型的放電頻率

表1 中華蟾蜍胚后各階段原始大腦皮層自發(fā)放電的出現(xiàn)時間 s

3 討 論

兩棲類原始大腦皮層位于端腦背側(cè)，側(cè)腦室上方，主要司嗅覺作用，但已是機體機能協(xié)調(diào)和整合活動的原始中樞［7］。

實驗結(jié)果表明，從圓錘狀肢芽期到成體期，連續(xù)簇狀放電占總放電數(shù)量的比例逐漸增加，說明某些特異神經(jīng)元興奮性可能隨發(fā)育的進行呈增強的趨勢。變態(tài)完成期和成體期單個放電、簇狀放電、不規(guī)則放電所占比例類似，這一結(jié)果可能說明變態(tài)期時原始大腦皮層的發(fā)育程度已經(jīng)接近成體期。連續(xù)放電所占比例的減少可能和發(fā)育過程中神經(jīng)元的凋亡有關(guān)［5，8］。

另外，中華蟾蜍端腦原始大腦皮層的電生理特性可能與神經(jīng)細胞的興奮性程度有關(guān)。在中華蟾蜍發(fā)育的較早階段，功能性神經(jīng)細胞數(shù)量較少，神經(jīng)系統(tǒng)的功能尚未完全形成，因此細胞興奮性較低，個別放電類型的數(shù)量較少，頻率較低，單個放電的時程較長，為一種慢去極化放電［9］。伴隨著發(fā)育的進行，細胞增殖、分化，功能性神經(jīng)元的興奮性增加，細胞放電類型、頻率和數(shù)量均有增加的趨勢，單個放電時程縮短，成為快去極化放電，表明神經(jīng)元的興奮性提高。神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中神經(jīng)細胞的增殖、遷移、限定、分化、建立突觸聯(lián)系，從而產(chǎn)生生理功能。在這一系列的過程中，大約有20%～90%的神經(jīng)元發(fā)生了退化、衰退和死亡。神經(jīng)細胞在發(fā)育過程中的增殖和退化可能是導致某些自發(fā)放電形式的數(shù)量或頻率出現(xiàn)差異的原因［10－11］。

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