前列地爾納米乳凍干工藝研究

冉海東，孫寧云，張軍東，李 娟＊，廉云飛，房秋雨

（1.中國(guó)藥科大學(xué)，江蘇 南京 210009；2.上海信誼藥廠有限公司，上海 201206）

前列地爾（alprostadil）是天然前列腺素類物質(zhì)［1］。前列地爾具有廣泛的生物活性，在心腦血管疾病治療中有著廣泛應(yīng)用［2－3］。前列地爾穩(wěn)定性差，易水解。前列地爾納米乳是將前列地爾溶于注射用油后再分散于水相中而形成的納米乳注射液。前列地爾納米乳在生物體內(nèi)不穩(wěn)定［4－5］，常溫放置會(huì)發(fā)生分層、絮凝及降解等。將納米乳制成干乳劑能顯著提高其常溫放置穩(wěn)定性，如丙泊酚干乳劑、紫杉醇干乳劑。本文采用冷凍干燥法［6］將前列地爾納米乳制成干乳劑，并考察了凍干保護(hù)劑種類和冷凍干燥工藝，旨在確定最佳凍干工藝，提高前列地爾納米乳穩(wěn)定性。

1 儀器與材料

ZS90激光粒度儀（英國(guó)馬爾文儀器有限公司）；東富龍LYO－13冷凍干燥機(jī)（上海東富龍科技股份有限公司）；IKAT25高速分散機(jī)（德國(guó)IKA公司）；S－3400N掃描電子顯微鏡、H600透射電鏡（株式會(huì)社日立制作所）；DSC204F1型差示掃描量熱儀（德國(guó)Netzsch公司）Ailgent 1100（美國(guó)安捷倫科技公司）；FB－110Q均質(zhì)機(jī)（上海勵(lì)途機(jī)械設(shè)備有限公司）；卡爾費(fèi)休水分測(cè)定儀ZKF－1（上海超精科技有限公司）。

前列地爾原藥（吉林英聯(lián)生物制藥股份有限公司，20120801）；卵磷脂（德國(guó)Lipoid公司，EL12021）；大豆油（鐵嶺北亞藥用有限公司，121102003）；油酸（上海東尚科技有限公司，520200）；甘油（汕頭紫光氨基酸有限公司，120516）海藻糖、麥芽糖（阿拉丁試劑公司，J1216051）甘露醇（藥用級(jí)，法國(guó)羅蓋特公司，E988G）；乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇（藥用級(jí)，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；其它試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 前列地爾納米乳及凍干乳劑制備

按前列地爾納米乳制備方法制備納米乳液，滅菌罐裝后得前列地爾納米乳劑。將制得納米乳液加入凍干保護(hù)劑后分裝于10mL西林瓶中，每瓶裝量2mL；最終優(yōu)化的凍干工藝為：將樣品放入－20℃冰箱預(yù)凍12h，然后放入凍干機(jī)，經(jīng)－45℃快速預(yù)凍2h，抽真空0.34mbar；升溫至－35℃保持36h，繼續(xù)升溫至－10℃保持4h，升溫至15℃保持6h，無菌封裝后即得凍干樣品。

2.2 納米乳粒徑測(cè)定

將納米乳液稀釋5000倍，在25℃下，置于激光粒度儀的樣品池中，測(cè)定乳液的粒徑、多分散系數(shù)（凍干劑則加等量水復(fù)溶后再稀釋相同倍數(shù)進(jìn)行粒徑測(cè)定）。如圖1，所制得的納米乳液平均粒徑和PDI分別為（164.7±21.9）nm、0.066。

圖1 前列地爾納米乳平均粒徑

2.3 納米乳中前列地爾含量及雜質(zhì)測(cè)定

2.3.1 色譜條件 色譜柱為 Waters Symmetry C18色譜柱，以0.0067mol／L磷酸鹽緩沖液（pH為6.3）－乙腈（3∶1）為流動(dòng)相；流速為1mL／min；柱后反應(yīng)液為1mol／L氫氧化鉀溶液，柱后反應(yīng)管為聚四氟乙烯管（φ0.5mm×10m）；柱溫60℃；檢測(cè)波長(zhǎng)278nm。進(jìn)樣量：20μL。

2.3.2 含量測(cè)定 精密量取前列地爾納米乳5mL，破乳后加1／1000磷酸定容，過預(yù)處理柱后用甲醇洗脫于蒸餾瓶中，減壓蒸干溶解進(jìn)樣，以內(nèi)標(biāo)法計(jì)算得樣品含量為：99.5%；雜質(zhì)A1為0.1μg／mL。凍干劑則加等量水復(fù)溶后再進(jìn)行測(cè)定。

2.4 凍干保護(hù)劑初篩

凍干過程是個(gè)復(fù)雜的相變過程，耗時(shí)長(zhǎng)，耗電量大。凍融試驗(yàn)［7］是將樣品放至低溫冰箱進(jìn)行預(yù)凍，而后置室溫溶解。凍融試驗(yàn)耗時(shí)短，耗電量小，易篩選。因此本實(shí)驗(yàn)采用凍融試驗(yàn)進(jìn)行保護(hù)劑初篩。

2.4.1 保護(hù)劑種類初篩 精密量取前列地爾納米乳8份，每份2mL。于乳劑中分別加入甘露醇、乳糖使糖濃度為5%（W／V）；加入山梨醇、麥芽糖、海藻糖、葡萄糖、蔗糖使其濃度為10%（W／V）；另一份作為空白。輕輕振蕩乳液，待其完全溶解并混合均勻后放入－20℃冰箱中預(yù)凍12h。待其完全凍實(shí)，觀察外觀；復(fù)溶后測(cè)定其平均粒徑及PDI，比較與凍干前納米乳液粒徑區(qū)別。如表1所示，保護(hù)劑對(duì)凍干產(chǎn)品有明顯保護(hù)效果；在相同試驗(yàn)條件下處方4、5、6、7平均粒徑較凍干前無顯著變化。因此初步篩選蔗糖、麥芽糖、葡萄糖、海藻糖作為凍干保護(hù)劑。

表1 加入不同凍干保護(hù)劑凍融后平均粒徑及PDI

2.4.2 保護(hù)劑濃度初篩 精密量取前列地爾納米乳20份，每份2mL。于乳劑中分別加入蔗糖、麥芽糖、葡萄糖、海藻糖，添加每種糖使其濃度分別為1%、5%、10%、15%、20%（W／V）；處理方法同“2.4.1”。結(jié)果顯示，1%和20%的糖預(yù)凍后粒徑變化明顯，因此初步選擇5%、10%、15%（W／V）四種糖濃度進(jìn)一步篩選。

2.5 凍干保護(hù)劑優(yōu)化

精密量取納米乳劑12份，每份2mL；于乳劑中分別加入葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、海藻糖使其濃度分別為5%、10%、15%，輕輕振蕩乳液，待其完全溶解并混合均勻后放入－20℃冰箱中預(yù)凍12h；而后進(jìn)行冷凍干燥61h，以凍干乳劑的外觀、復(fù)溶后外觀、平均粒徑、復(fù)溶速度為指標(biāo)來篩選凍干保護(hù)劑種類及濃度（表2）。

表2 不同種類及濃度凍干保護(hù)劑對(duì)前列地爾凍干納米乳性質(zhì)的影響

表2顯示，10%海藻糖加入后，凍干復(fù)溶速度較快，凍干后外觀平滑緊致，復(fù)溶后呈半透明狀且粒徑及PDI無顯著性變化。這可能與海藻糖的特殊空間結(jié)構(gòu)有關(guān)：它的椅式和船式構(gòu)象間轉(zhuǎn)變影響了干燥狀態(tài)下的磷脂膜結(jié)構(gòu)，進(jìn)而維持無水狀態(tài)時(shí)膜的穩(wěn)定。同時(shí)通過調(diào)節(jié)其濃度能夠抑制冰晶的生長(zhǎng)，降低其對(duì)乳滴的擠壓和機(jī)械損傷作用，保護(hù)乳滴的結(jié)構(gòu)，從而達(dá)到非常好的凍干保護(hù)效果。因此篩選出最佳保護(hù)劑為10%海藻糖。

2.6 凍干工藝考察

冷凍干燥過程可分為預(yù)凍階段、第一階段干燥和第二階段干燥。其過程中影響凍干效果和產(chǎn)品質(zhì)量的因素較多，下面分別對(duì)預(yù)凍溫度、速度、預(yù)凍時(shí)間以及干燥時(shí)間等因素分別進(jìn)行考察。

2.6.1 預(yù)凍溫度 預(yù)凍溫度是冷凍干燥過程中的一個(gè)重要參數(shù)，對(duì)產(chǎn)品的質(zhì)量影響較大。精密量取前列地爾納米乳4份，每份1mL。于乳劑中分別加入10%（W／V）海藻糖1mL，輕微振蕩至其完全溶解后，分別放入低溫冰箱（－20℃，12h）、（－45℃ ，12h）、（－70℃，12h）中預(yù)凍，隨后進(jìn)行冷凍干燥除去水分。凍干結(jié)束后，將制得的凍干乳加入注射溶媒進(jìn)行復(fù)溶，經(jīng)水合振蕩后還原成乳劑，觀察外觀，測(cè)定粒徑變化。結(jié)果顯示：三種預(yù)凍溫度均能使凍干品表面呈光滑的玻璃狀，復(fù)溶外觀良好。粒徑分別為（173.5±34.6）nm、（175.3±35.1）nm、（171.5±33.9）nm。三種預(yù)凍溫度均能達(dá)到良好保護(hù)效果，為節(jié)約能源選?。?0℃12h為最佳預(yù)凍溫度。

2.6.2 凍干機(jī)初始溫度 預(yù)凍就是將溶液中的自由水固化，賦予待干燥的產(chǎn)品于干燥前相同的形態(tài)，防止抽真空干燥時(shí)起泡、濃縮和溶質(zhì)移動(dòng)等不可逆變化的發(fā)生。因此冷凍干燥過程預(yù)凍溫度必須低于樣品最低共熔點(diǎn)10～20℃（圖2）。本實(shí)驗(yàn)選擇－45℃為凍干機(jī)預(yù)凍溫度。

圖2 凍干納米乳最低共熔點(diǎn)和玻璃化轉(zhuǎn)變溫度

2.6.3 預(yù)凍時(shí)間 將加入海藻糖作為保護(hù)劑的樣品平行制得3份，分別于－45℃冷阱中預(yù)凍1、2、4h時(shí)，而后進(jìn)行冷凍干燥除去水分。通過產(chǎn)品質(zhì)量，確定最佳預(yù)凍時(shí)間。試驗(yàn)結(jié)果顯示，預(yù)凍1h樣品平均粒徑較大為（203.3±34.2）nm；預(yù)凍2h、4h平均粒徑無顯著差異，本實(shí)驗(yàn)確定預(yù)凍時(shí)間為2h。

2.6.4 干燥溫度、時(shí)間 ①第一階段干燥：按凍干保護(hù)劑加入比例精密量取樣品9份，共18mL。于－20℃預(yù)凍12h，－45℃冷阱中預(yù)凍2h后進(jìn)行干燥除去水分，將樣品分別設(shè)置第一階段干燥溫度為－40℃、－35℃、－30℃。干燥時(shí)間分別為24、36、48h。通過產(chǎn)品質(zhì)量確定第一階段干燥溫度和時(shí)間，平行做三組。由圖3－B看出，干燥溫度為30℃時(shí)產(chǎn)品平均粒徑變化較大；干燥溫度為40℃、35℃時(shí)粒徑變化則不明顯。干燥時(shí)間為24h時(shí)，產(chǎn)品平均粒徑波動(dòng)明顯。干燥時(shí)間為36h、48h干燥溫度為35℃、40℃產(chǎn)品質(zhì)量較優(yōu)。從能源節(jié)約方面考慮第一階段干燥時(shí)間保持36h，溫度保持－35℃；② 第二階段干燥：按上述已確定條件處理樣品，將樣品第一階段溫度設(shè)置為－35℃干燥36h，而后第二階段干燥溫度設(shè)置為10℃、15℃、20℃，干燥時(shí)間分別為4h、6h、8h。通過產(chǎn)品含水量確定第二階段干燥溫度及時(shí)間。由圖3－A看出，干燥時(shí)間為10℃時(shí)，含水量在4%以上，不利于凍干樣品的保護(hù)；而干燥溫度15℃、20℃時(shí)含水量差別不明顯，且此時(shí)干燥時(shí)間基本無影響。含水量在1.5%以內(nèi)時(shí)表示很難除去，但對(duì)樣品穩(wěn)定性影響不大；而溫度越高對(duì)設(shè)備質(zhì)量要求越高，干燥時(shí)間越長(zhǎng)，能源消耗越大。綜合考慮，第二階段干燥時(shí)間為6h、溫度為15℃。

圖3 干燥時(shí)間及溫度與平均粒徑（A）、含水量（B）的關(guān)系

2.7 凍干乳的表征

2.7.1 掃描電鏡 分別取海藻糖、麥芽糖做保護(hù)劑的凍干樣品少量，快速放入兩面的SEM樣品盤后放入JFC－1600，調(diào)加速電壓15kV進(jìn)行噴金后放入S－3400N掃描電鏡進(jìn)行觀察（圖4－a，b）。加入海藻糖做保護(hù)劑，納米乳能夠完整的嵌入海藻糖基質(zhì)中，形成多層次結(jié)構(gòu)，有效保護(hù)納米乳凍干過程免受破壞；而麥芽糖則不能形成有效保護(hù)結(jié)構(gòu)。

2.7.2 透射電鏡 取樣品放入分析池，用純化水分散稀釋后，滴入銅網(wǎng)分析片，用2%的磷鎢酸著色。在空氣中干燥后，置于透射電鏡觀察（如圖4－c，d）?？梢钥吹郊{米乳凍干前后乳粒呈球形，且分布均勻，無明顯變化。

圖4 前列地爾掃描電鏡和透射電鏡

2.8 凍干納米乳穩(wěn)定性

將納米乳與凍干乳樣品同時(shí)置于室溫放置3個(gè)月測(cè)定其粒徑及含量變化（如表4）。前列地爾納米乳經(jīng)凍干后放置3個(gè)月平均粒徑、含量無顯著變化，而未經(jīng)凍干的納米乳常溫放置3個(gè)月后含量下降約7.3%，雜質(zhì)A1增至3.4μg／mL，已超出其限度3.0μg／mL。前列地爾凍干納米乳穩(wěn)定性明顯優(yōu)于前列地爾納米乳。

表4 前列地爾納米乳及凍干乳常溫放置3個(gè)月綜合指標(biāo)變化

3 討論

納米乳屬于熱力學(xué)不穩(wěn)定體系，前列地爾納米乳不能夠常溫保存，滅菌過程易加速降解，增加其雜質(zhì)含量。將其制成凍干納米乳后，室溫長(zhǎng)期放置能夠保證其粒徑及主藥含量保持不變，同時(shí)減少滅菌過程對(duì)主藥含量的影響，雜質(zhì)A1能夠有效控制在限量3μg／mL以內(nèi)。因此將前列地爾制成凍干納米乳劑有著廣闊的應(yīng)用前景。

凍干保護(hù)劑的選擇或用量控制不好［8］，凍干后的產(chǎn)品容易形成不易溶解的蜂窩狀或粉狀，最終導(dǎo)致納米乳不能恢復(fù)原有性狀。實(shí)驗(yàn)中15%的蔗糖出現(xiàn)噴瓶現(xiàn)象可能是由于產(chǎn)品濃度大，不均一，加熱過程中造成制品上下溫差過大，下部制品的結(jié)晶不是從固體到氣體升華，而是從固體、液體到氣體蒸發(fā)，形成噴瓶［9］。5%的糖類由于濃度過低沒有能夠有效降低制品的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度，而達(dá)不到骨架支撐作用。10%海藻糖能起到很好的保護(hù)作用，但作為凍干保護(hù)劑，暴露在空氣中時(shí)海藻糖較易吸潮。更優(yōu)選擇有待于進(jìn)一步深入研究。

干燥過程分為升華干燥和解析干燥［10］。升華干燥過程不允許冰出現(xiàn)融化，水蒸氣必須低于物料凍結(jié)點(diǎn)的飽和蒸汽壓。本實(shí)驗(yàn)第一階段干燥不能加熱過快，否則制品的上下部位易出現(xiàn)不均勻。凍干產(chǎn)品易吸潮，尤其在含有少量水分時(shí)，因此本實(shí)驗(yàn)在第二階段干燥時(shí)嚴(yán)格控制干燥溫度，目的就是最大限度降低水分含量，當(dāng)含水量在1.5%以下時(shí)，則對(duì)產(chǎn)品質(zhì)量基本無影響。

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