巨細胞病毒啟動子序列檢測的復合實時定量PCR方法的建立

苗玉發(fā)，王三龍，周曉冰，霍 艷，耿興超，呂建軍，汪巨峰，李 波

(中國食品藥品檢定研究院國家藥物安全評價監(jiān)測中心，北京 100176)

巨細胞病毒(cytomegalovirus，CMV)啟動子是啟動真核基因表達的強力啟動子，常參與構建高效真核表達載體，并廣泛應用于基因治療產(chǎn)品和DNA疫苗的制備。本研究所涉及的基因治療產(chǎn)品是插入CMV啟動子和人粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(granulocyte macrophage colony stimulating factor，GM-CSF)基因的單純皰疹病毒載體疫苗，CMV啟動子能啟動疫苗高效表達GM-CSF，導致局部樹突狀細胞(dendritic cells，DC)分裂和成熟，從而誘導和增強抗腫瘤免疫反應。本研究的目的是探索建立CMV啟動子序列檢測的復合實時定量PCR方法，并期望使建立的方法成為含CMV啟動子的基因治療產(chǎn)品的通用檢測方法。

1 材料與方法

1.1 生物材料

基因治療產(chǎn)品，2 ×1011pfu·L－1，由某生物科技公司提供。50 mg·L－1CMV啟動子標準品上海生工技術有限公司。β肌動蛋白基因標準品，1×1014拷貝(copies)·L－1，由上海基康生物技術公司提供。

1.2 試劑及儀器

小鼠基因組DNA提取試劑盒，購自中國北京Tiangen Biotech公司;病毒DNA提取試劑盒購自中國上海捷瑞生物工程公司;實時定量PCR反應試劑購自日本TaKaRa公司;SYBR GreenⅠ染料購自中國廈門百維信生物公司;ABI PRISM 7000型實時熒光定量PCR儀購自美國ABI公司;超聲波組織勻漿器購自德國IEKA公司;5810R型臺式高速離心機購自德國艾本德公司。

1.3 動物

BALB/c小鼠，SPF級，體質量20～25 g，合格證號:SCXK(京)2009-0017，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供。

1.4 小鼠基因組DNA和基因治療產(chǎn)品病毒DNA的提取

小鼠放血處死后，取新鮮心臟或肝組織，稱取約25 mg，去除結締組織，用剪刀剪成細小碎塊，加入DNA提取緩沖液，然后按照小鼠基因組DNA提取試劑盒說明書操作。取約200 μL基因治療產(chǎn)品溶液，以12 500×g離心1.5 h，取出下層溶液及沉淀，加入到1.5 mL離心管中，加入20 μL蛋白酶K，消化1～2 h或過夜，然后按照病毒DNA提取試劑盒說明書操作。

1.5 單獨PCR反應體系建立及驗證

1.5.1 CMV啟動子引物和探針的設計、合成及標準品的構建

針對CMV啟動子序列用ABI Primer Express v2.0軟件設計的上游引物為 5'AGACTTGGAAATCCCCGTGAGT3'，下 游 引 物 為 5'CGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGT3'，探 針 為5'AACCGC TATCCACGCCCATTGATG3'。探針5'端報告基團用FAM標記，3'端淬滅基團用TAMRA標記。擴增產(chǎn)物長度為93 bp。將含有上述CMV啟動子引物和探針序列的長度為107 bp的基因片段克隆到pUC57質粒中，克隆位點在SamⅠ酶切位點，通過紫外法對質粒進行準確定量。對構建好的質粒進行測序，證實插入的目的片段序列正確。引物、探針和質粒標準品由上海生工技術服務有限公司合成。

1.5.2 反應體系的優(yōu)化

反應條件:94℃ 3 min;94℃ 30 s，60℃ 1 min，40個循環(huán)。

以CMV啟動子標準品為擴增對象，對反應體系進行優(yōu)化。上下游引物濃度分為40，200和800 nmol·L－1，共9種不同組合;探針濃度設置:50，100，200 和400 nmol·L－1;Ex Taq HS 聚合酶濃度設置:12 500，25 000，50 000 和100 000 U·L－1;Mg2+濃度設置:2，3，4和5 mmol·L－1。分別用上述各成分的不同濃度對等量的CMV啟動子標準品進行擴增，選擇Ct值最小，Delta Rn較大的濃度。擴增曲線為循環(huán)數(shù)對Delta Rn作圖。

1.5.3 單獨PCR反應的特異性、重復性、定量限和靈敏度

用SYBR GreenⅠ熔解曲線分析引物對基因治療產(chǎn)品擴增的特異性。用不同濃度的CMV啟動子標準品，在同一個反應中重復測定8次，計算各個復孔Ct值的變異系數(shù)(CV)，以及由此外推出拷貝數(shù)的CV值。對1∶10倍比稀釋的CMV啟動子標準品進行擴增，找出標準曲線線性范圍內(nèi)的最小值即定量限。將×102的CMV啟動子標準品以1∶2倍比稀釋一系列濃度，找出能檢測到的最小值即靈敏度。

1.6 復合PCR反應建立

1.6.1 β肌動蛋白基因引物和探針的設計、合成及標準品的構建

從NCBI基因庫中以Blast方式查獲β肌動蛋白基因的cDNA序列(GeneID:218370)，以此為模板用Primer Express v2.0進行引物及探針的設計。上游引物為 5'CCTGAGGCTCTTTTCCAGCC3'，下游引物為 5'TAGAGGTCTTTACGGATGTCAACGT3'，探 針 為 5'TCCTTCTTGGGTATGGAATCCTGTGGC3'。探針5'端報告基團用VIC標記，3'端淬滅基團用TAMRA標記。擴增產(chǎn)物長度為109 bp。將含有上述引物和探針序列的基因片段插入質粒中，構建β肌動蛋白基因標準品。引物、探針和β肌動蛋白基因標準品由上?；瞪锛夹g公司合成。用SYBR GreenⅠ熔解曲線分析引物對小鼠基因組擴增的特異性。

1.6.2 復合PCR擴增效率的比較

基因治療產(chǎn)品和β肌動蛋白基因標準品分別以1∶10倍比稀釋后，按優(yōu)化好的反應條件，進行基因治療產(chǎn)品單獨的標準曲線擴增反應(monoplex)、β肌動蛋白基因標準品monoplex以及基因治療產(chǎn)品和β肌動蛋白基因標準品混合在一起的復合反應(multiplex)。通過公式 E(efficiency)=10［－1/(－slope)］計算擴增效率。通過對復合擴增效率和單獨擴增效率的比較，判斷兩套引物和探針組合在同一管中進行反應時，是否存在相互影響因素。

1.7 統(tǒng)計學分析

用SPSS 11.5和華西大學統(tǒng)計學教研室開發(fā)的PEMS v3.1軟件對數(shù)據(jù)進行直線回歸分析、作圖及相關性分析。

2 結果

2.1 引物特異性

兩對引物分別對基因治療產(chǎn)品(圖1A)和小鼠基因組(圖1B)擴增后，在80～85℃間有一特異性的產(chǎn)物峰，沒有出現(xiàn)雙峰或異常增寬峰?；蛑委煯a(chǎn)品擴增反應中的無模板對照(圖1A)有一引物二聚體峰，兩對引物特異性都較高。

2.2 優(yōu)化的反應體系

當兩引物濃度均≥200 nmol·L－1，得到最大的Delta Rn值和最小的Ct值(圖2A group a)，檢測的靈敏度最高。探針濃度大于100 nmol·L－1時(圖2B group a，b)，得到了較大的Delta Rn值和最小的Ct值。所有的酶濃度出現(xiàn)相同的Ct值和相當?shù)臒晒庵?圖 2C)。Mg2+濃度在 2 ～5 mmol·L－1間變化時，對PCR擴增幾乎沒有影響(圖2D)。

優(yōu)化后的PCR反應體系為:總體積25 μL，上下游引物 260 nmol·L－1，探針 100 nmol·L－1，5 ×PCR 緩 沖 液 5 μL，dNTP 200 μmol·L－1，Mg2+3 mmol·L－1，Ex Taq HS 聚 合 酶 1.5 U，模 板1.5 μL，滅菌水 16 μL。

Fig.1 Dissociation curve of gene therapy product(A)and mouse genome(B).NTC:no template control.

Fig.2 Amplification curve for optimization of reaction system.A:different primer concentration;B:different probe concentration;C:different polymerase concentration;D:different Mg2+concentration.Groups a，b and c are distinguished by different value of Delta Rn.

2.3 單獨PCR反應的重復性

表1結果顯示，Ct值的變異系數(shù)都小于2%，拷貝數(shù)的變異系數(shù)在20%左右，顯示PCR具有較好的重復性，即此PCR反應體系精確性較好。

2.4 單獨PCR反應的定量限和靈敏度

圖3結果顯示，CMV啟動子標準品拷貝數(shù)在1.5 ×102～1.5 ×107范圍內(nèi)，標準曲線呈線性，即定量的線性范圍達到6個數(shù)量級，定量限為1.5×102拷貝，反應體系的靈敏度為30拷貝。

Tab.1 Reproducibility of PCR reaction

Fig.3 Limit of quantification of reaction system.A:amplification curve;B:standard curve.a，b，c，d，e，f，g and h are a series of ×107，×106，×105，×104，×103and ×102CMV promoter standard material，normal mouse tissue negative control and no templet control，respectively.

2.5 CMV啟動子標準品和基因治療產(chǎn)品擴增效率

圖4結果顯示，兩者標準曲線的相關系數(shù)R2都大于0.99。基因治療產(chǎn)品的擴增效率為2.0076，CMV啟動子質粒標準品的擴增效率為2.0138，兩者的擴增效率都較高，且相近，構建的標準品可以對基因治療產(chǎn)品準確定量。

Fig.4 Comparison between amplification efficiency of standard material(A)and gene therapy product(B).

2.6 基因治療產(chǎn)品和β肌動蛋白基因標準品擴增效率

圖5結果顯示，不管是基因治療產(chǎn)品還是β肌動蛋白基因標準品在單獨反應時，擴增效率都較高，復合反應時擴增效率都稍有降低，β肌動蛋白基因標準品擴增效率從2.9417減至2.7532，基因治療產(chǎn)品擴增效率從2.1408減至2.1154。

Fig.5 Amplification efficiency of gene therapy product and β-actin gene standard material.A:standard curve of β-actin gene monoplex and multiplex reaction;B:standard curve of gene therapy product monoplex and multiplex reaction;C:standard curve of β-actin gene and gene therapy product multiplex reaction.

3 討論

應用定量PCR進行生物技術藥物的生物分布研究時，在描述結果時常常有不同的表示方法，如拷貝/μL，拷貝/mg 組織等［1－5］。由于 DNA 抽提效率不同，這些表示方法都不能準確地表示定量。即便采用國際上常用的拷貝/ng基因組來表示，也有一定的不足。應用此單位的前提是所檢測的目的基因在整個基因組中所占的比例要足夠的少，即要保證所檢測基因的吸光度與基因組的吸光度相比可以忽略。當目的基因含量越多時，這種表示方法就越不準確。為了減少這些常用單位的誤差，需要對反應體系中的基因組進行單獨定量。β肌動蛋白基因是小鼠基因組中的一種管家基因，一個基因組含有兩個拷貝的β肌動蛋白基因，它能在不同組織中相對恒定地表達［6－7］。利用β肌動蛋白基因作為內(nèi)參，定量了 β肌動蛋白基因的拷貝數(shù)，就可以定量基因組的拷貝數(shù)，從而可以把結果以拷貝/基因組或拷貝/細胞來表示，使結果的表達更為科學和準確。

在進行β肌動蛋白內(nèi)參基因擴增反應時，待測基因和內(nèi)參基因是在同一個反應體系中進行的。從理論上來講，為了得到準確的多重定量結果，必須保證其中的一個擴增反應不能影響另一個擴增反應。否則，豐度較高的基因的擴增就會抑制豐度較低的基因的擴增，從而影響定量的準確性［8］。在本研究中，相比于單獨反應，復合反應時兩擴增效率都輕微降低，證實兩個擴增反應都相互受到了輕微影響。但是，擴增效率下降都是輕微的，對定量的準確性影響不大。對β肌動蛋白內(nèi)參基因擴增時發(fā)現(xiàn)，VIC熒光染料在擴增后的熒光值(Delta Rn)比較低，10倍系列稀釋的標準品制作的標準曲線斜率也比較低(理想的斜率為3.322)。通過SYBR GreenⅠ法對其標準品進行驗證，結果顯示標準品良好，又通過對擴增過程中熒光信號值的變化(component)進行深入的分析發(fā)現(xiàn)，是由于探針的熒光染料標記不穩(wěn)定所導致。盡管如此，還是對β肌動蛋白內(nèi)參基因校正的復合反應體系進行了初步的摸索，基本上建立了β肌動蛋白內(nèi)參基因校正的復合定量PCR方法。

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