基于近紅外指紋圖譜的芡實(shí)藥材快速分析*

陳蓉,陳偉,吳啟南

(1.蘇州市食品藥品檢驗(yàn)所,蘇州 215104；2.蘇州市中醫(yī)醫(yī)院,蘇州 215006；3.南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,南京 210046)

基于近紅外指紋圖譜的芡實(shí)藥材快速分析*

陳蓉1,陳偉2,吳啟南3

(1.蘇州市食品藥品檢驗(yàn)所,蘇州 215104；2.蘇州市中醫(yī)醫(yī)院,蘇州 215006；3.南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,南京 210046)

目的 采用近紅外光譜技術(shù)對(duì)不同產(chǎn)地芡實(shí)進(jìn)行鑒定,建立基于近紅外指紋圖譜的快速分析方法。方法17批不同產(chǎn)地的芡實(shí),采用VARIAN CARY5000型紫外可見近紅外分光光度計(jì)采集光譜,利用Origin 7.5版和SPSS 18.0版軟件進(jìn)行譜圖相關(guān)性分析和產(chǎn)地聚類。結(jié)果 17個(gè)產(chǎn)地芡實(shí)特征峰相關(guān)性顯著,產(chǎn)地區(qū)分明顯。結(jié)論 近紅外光譜法能夠簡(jiǎn)便快捷無損地對(duì)芡實(shí)進(jìn)行鑒別,可為中藥材的快速檢測(cè)提供一定參考。

芡實(shí);近紅外光譜;分析,快速

近紅外光譜(near-infrared spectroscopy)是介于可見光譜區(qū)與中紅外譜區(qū)之間的譜帶。譜區(qū)范圍為4 000～12 500 cm-1(800～2 500 nm),其吸收譜帶主要是C-H、N-H、O-H等含氫基團(tuán)在中紅外吸收基頻的倍頻及合頻。該技術(shù)主要優(yōu)點(diǎn)是:樣品制備過程簡(jiǎn)單,無損,無污染；能同時(shí)快速測(cè)定同一樣本中不同成分,且可重復(fù)測(cè)量；質(zhì)量過程可控,滿足在線檢測(cè)需求；適用于固態(tài)、粉粒態(tài)、半固態(tài)、液態(tài)等各種樣本。主要缺點(diǎn)是:檢測(cè)限高,依賴樣品質(zhì)量；靈敏度低,要求樣品中成分達(dá)到百萬級(jí)以上；建模困難,阻礙了近紅外光譜技術(shù)普及[1]。

芡實(shí)為睡蓮科植物芡(Euryale feroxSalisb)的干燥成熟種仁[2]。始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》,列為上品[3]。芡實(shí)含有多糖、氨基酸、淀粉、黃酮等多種成分,受地理環(huán)境因素的影響,其化學(xué)成分也不盡相同,直接測(cè)定粉末近紅外光譜,利用各個(gè)化學(xué)成分吸收特征的疊加,結(jié)合中紅外光譜[4],具有指紋性[5-7]。

1 材料與方法

1.1 藥材 芡實(shí)來源于全國16個(gè)產(chǎn)地及1個(gè)對(duì)照藥材,經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院吳啟南教授鑒定為睡蓮科植物芡(Euryale feroxSalisb)的干燥成熟種仁。具體信息見表1。

1.2 儀器與設(shè)備 VARIAN CARY5000紫外可見近紅外分光光度計(jì),配備積分球漫反射附件,異面復(fù)式Littrow單色器(美國VARIAN公司)；DHG-9023A型恒溫干燥箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)。

1.3 方法 樣品60℃烘干12 h,不經(jīng)其他處理,取約2 g裝于石英瓶中測(cè)量杯中,以金箔為參比,采用積分漫反射測(cè)定。光譜分辨率為8 cm-1,測(cè)量范圍2 500～800 nm,掃描次數(shù)64次,掃描速度0.633 0 cm·s-1,每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3次,將各次測(cè)得的光譜曲線加和取平均得到各樣品的數(shù)據(jù)曲線。

1.4 數(shù)據(jù)處理 利用Origin 7.5版、SPSS 18.0版軟件對(duì)近紅外光譜進(jìn)行數(shù)據(jù)處理分析。

2 結(jié)果

2.1 芡實(shí)近紅外光譜測(cè)定結(jié)果 不同產(chǎn)地芡實(shí)樣品的近紅外圖譜如圖1所示。各產(chǎn)地波形和吸光度大小有很大的相似性,表明芡實(shí)藥材質(zhì)量總體平穩(wěn),變異趨勢(shì)較小。S3和S11吸光度較大。

表1 芡實(shí)樣品資料Tab.1 Sou rces of Euryales semen

另外,中藥材中水分差別較大,在近紅外圖譜中水峰位置常有較大的干擾,故掃描范圍避開水峰位置1 333～1 408 nm、1 785～1 923 nm[8]。此外,可使用紅外水分析儀在60℃下干燥至恒重后置于干燥器中使其溫度與室溫平衡后再采集近紅外光譜,以減少水分對(duì)分析的影響。

圖1 芡實(shí)近紅外原始圖譜Fig.1 Original NIR spectra of Euryales sem en

2.2 光譜波段的選擇 采用800～2 500 nm全波段范圍建立預(yù)測(cè)模型。當(dāng)選取的波長范圍為1 196～2 332 nm時(shí),特征峰較為明顯,故確定此區(qū)段為指紋區(qū),確定了8個(gè)共有吸收峰,峰位2 331.017 nm、峰位2 313.353 nm、峰位2 101.412 nm、峰位1 928.765 nm、峰位1 761.000 nm、峰位1 549.000 nm、峰位1 468.118 nm、峰位1 196.000 nm(圖2)。根據(jù)特征峰位,計(jì)算得到不同產(chǎn)地芡實(shí)的近紅外光譜差異(表2)。

2.3 光譜數(shù)據(jù)再處理 利用Origin7.5版軟件對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行微分,得到全光程范圍內(nèi)的近紅外一階導(dǎo)數(shù)、二階導(dǎo)數(shù)。

樣品的近紅外導(dǎo)數(shù)光譜見圖3。各產(chǎn)地芡實(shí)一階導(dǎo)數(shù)近紅外光譜的相應(yīng)吸收峰基本一致,主要反映了種子類藥材中植物淀粉多糖等的特征,但在1 350～1 450,1 850～2 250 nm范圍內(nèi),各產(chǎn)地光譜信號(hào)稍有不同,這些譜段的差異更加明顯。二階導(dǎo)數(shù)上增加了多點(diǎn)校正,使得譜圖更加平滑,差異較一階導(dǎo)數(shù)小,以上譜段中光譜信號(hào)的差異可能是由于各產(chǎn)地芡實(shí)化學(xué)成分的不同造成的。總體來說,樣品因種間差異,主要化合物的種類及含量會(huì)有差別,其特征信息很難從峰位、峰強(qiáng)、峰形方面直觀鑒別。但經(jīng)過數(shù)學(xué)處理提取特征信息后,便可應(yīng)用于分類鑒別。

2.4 特征峰相關(guān)性分析 對(duì)芡實(shí)近紅外圖譜共有峰位進(jìn)行相關(guān)性分析,以Pearson相關(guān)系數(shù)表示,得到共有峰的相關(guān)系數(shù)矩陣,見表3。

結(jié)果顯示,芡實(shí)近紅外光譜中有25對(duì)呈現(xiàn)顯著的正相關(guān)(P≤0.01),有3對(duì)呈正相關(guān)(0.01≤P≤0.05)。表明芡實(shí)近紅外光譜大多峰位之間有很好的協(xié)同作用,可以認(rèn)為其各共有峰之間彼此聯(lián)系。沒有呈負(fù)相關(guān)的峰位,說明芡實(shí)近紅外指紋圖譜中這些峰協(xié)同性性十分明顯,均衡性較好。

表2 芡實(shí)特征吸收峰位吸光度Tab.2 Absorbance of characteristic peaks of Euryales semen

圖2 芡實(shí)近紅外特征峰標(biāo)記Fig.2 Marks of characteristic peaks in NIR spectra Euryales semen

2.5 主成分分析 通過SPSS 18.0版軟件中的因子分析對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理。主成分的特征根及貢獻(xiàn)率是選擇主成分的依據(jù)。表描述了各成分的貢獻(xiàn)率,由表4可知,前3個(gè)成分P6、P7、P5的特征值＞0.110,即7.291,0.575,0.110,對(duì)總方差的累積貢獻(xiàn)率達(dá)99.698%,故選擇P6、P7、P5為主成分。

根據(jù)主成分計(jì)算公式可以得到兩個(gè)主成分與原8項(xiàng)指標(biāo)的線性組合如下,可計(jì)算綜合得分。

A1=0.135P1+0.134P2+0.134P3+0.132P4+ 0.137P5+0.137P6+0.137P7+0.096P8

A2=-0.235P1-0.253P2-0.282P3-0.019P4-0.028P5-0.037P6-0.026P7+1.240P8

A3=0.653P1+1.198P2+0.979P3-2.355P4+ 0.004P5-0.265P6-0.620P7+0.533P8

以主成分為變量得到三維loading圖(圖4)。在loading圖中選取距離原點(diǎn)較遠(yuǎn)的幾個(gè)點(diǎn),得到主成分1中變量的權(quán)重值,權(quán)重值越大表明該成分在決定樣品區(qū)分中的作用越大,其中前3名變量的權(quán)重值分別為0.997,0.997,0.996,分別為P6、P7、P5,它們的峰位分別為1 549.000,1 468.118,1 761.000 nm。與前面分析結(jié)果一致,即可判定P6、P7、P5為各產(chǎn)地芡實(shí)近紅外光譜的主成分。

2.6 聚類分析 將各色譜峰面積相對(duì)于稱樣量量化,運(yùn)用SPSS18.0版軟件對(duì)17個(gè)產(chǎn)地芡實(shí)樣品進(jìn)行系統(tǒng)聚類,方法為組間連結(jié),以夾角余弦作為樣品相似度的距離公式。當(dāng)類間距離在3.5時(shí),17個(gè)芡實(shí)樣品分為4類,聚類分析結(jié)果見圖5。通過聚類分析可以找到不同產(chǎn)地芡實(shí)之間的信息特征,達(dá)到鑒別區(qū)分的目的。Ⅰ類:四川成都、山東菏澤、安徽蕪湖、湖北武穴、對(duì)照藥材、湖南益陽、江蘇蘇州、江蘇寶應(yīng)、江蘇浦口；Ⅱ類:河北安國、湖北蘄春、廣東肇慶、廣東潮州、江蘇金湖、江蘇建湖；Ⅲ類:福建莆田；Ⅳ類:四川中江。當(dāng)類間距離在6.5時(shí),聚為三類,即福建莆田、四川中江和其他。而當(dāng)類間距離在25時(shí),所有的芡實(shí)聚為一大類。說明類間距離對(duì)分類起到?jīng)Q定性作用,福建莆田、四川中江兩地與其他產(chǎn)地差距較大。福建莆田芡實(shí)是引種品,其形態(tài)與其他產(chǎn)地芡實(shí)有差異,且長期處于加工食用狀態(tài),很少用于飲片生產(chǎn),生產(chǎn)目的性已發(fā)生改變。四川中江非芡實(shí)的道地產(chǎn)區(qū),種植規(guī)模較小,氣候溫?zé)?在一定程度上使其成分區(qū)別于其他產(chǎn)地。聚類分析表明,受生長環(huán)境、氣候等條件影響,不同產(chǎn)地芡實(shí)在本質(zhì)上所含的化學(xué)成分發(fā)生了變化,從而引起了分類上的差異。

A.一階導(dǎo)數(shù)圖譜;B.二階導(dǎo)數(shù)圖譜圖3 芡實(shí)近紅外一階二階導(dǎo)數(shù)圖譜A.first derivative spectra；B.second derivative spectraFig.3 First and second derivative NIR spectra of Euryales semen from different areas

表3 芡實(shí)中共有峰間相關(guān)性Tab.3 The correlation of common peak in Euryales semen

表4 特征值和貢獻(xiàn)率Tab.4 Eigenvalue and contribution rate %

圖4 芡實(shí)近紅外指紋圖譜三維投影圖Fig.4 3D loading scatter p lot of NIR fingerprint of Euryales semen

圖5 聚類分析結(jié)果Fig.5 Results of cluster analysis

以各共有峰為變量得到Score圖(圖6)。由圖可見4類樣品緊密地聚集在一起,各自分散在圖中的不同區(qū)域,使不同產(chǎn)地之間獲得了良好的區(qū)分,表明不同產(chǎn)地的芡實(shí)近紅外圖譜有一定的差別,能作為產(chǎn)地分類的依據(jù)。

圖6 芡實(shí)近紅外指紋圖譜Score圖Fig.6 Score spectra of NIR finger of Euryales semen

3 討論

本實(shí)驗(yàn)采用近紅外球面漫反射光譜測(cè)定了全國17個(gè)產(chǎn)地的芡實(shí)樣本近紅外光譜,并采用主成分分析結(jié)合聚類判別,建立了芡實(shí)近紅外指紋圖譜,結(jié)果表明近紅外光譜在芡實(shí)藥材產(chǎn)地鑒別和質(zhì)量評(píng)定中有一定的指導(dǎo)意義,建議作為芡實(shí)藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)的手段之一,也可以作為芡實(shí)藥材真?zhèn)舞b別的一種新的手段。利用軟件建立標(biāo)準(zhǔn)化模型,再進(jìn)一步對(duì)模型進(jìn)行驗(yàn)證,是以芡實(shí)中特有的化學(xué)成分為基礎(chǔ)的,定性鑒別模型方法學(xué)的重要手段。這也可以指導(dǎo)芡實(shí)等中藥材研究的新思路。此外,通過增大樣本量,確定成分含量,加以MATLAB、OPUS、TQ、SIMCA-P等軟件的分析,結(jié)合中紅外和拉曼光譜,可以進(jìn)一步對(duì)蘇芡和刺芡進(jìn)行區(qū)分。

在藥檢工作中,近紅外技術(shù)用于西藥的快速現(xiàn)場(chǎng)篩查已十分廣泛,藥品快檢車搭載的近紅外儀已經(jīng)建立了不少品種的模型[9-11],為鑒別假劣藥品提供了有效的技術(shù)支持。中藥品種多,產(chǎn)地廣,易導(dǎo)致混亂,作為中藥品質(zhì)評(píng)價(jià)提升的一個(gè)手段,中紅外結(jié)合近紅外分析雖是傳統(tǒng)技術(shù),但通過現(xiàn)代的數(shù)據(jù)分析軟件和計(jì)算藥學(xué)的發(fā)展,在評(píng)價(jià)方面將會(huì)得到進(jìn)一步的提升。模式識(shí)別、人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)、褶合變換的應(yīng)用,使得模型趨于成熟。因此,紅外技術(shù)在保證中藥質(zhì)量,促進(jìn)中藥產(chǎn)業(yè)持續(xù)發(fā)展方面具有廣闊的前景。

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DOI 10.3870/yydb.2014.05.032

Rapid Analysis for Fingerprint of Euryales Semen by Near Infrared Spectroscopy

CHEN Rong1,CHEN Wei2,WU Qi-nan3
(1.Suzhou Institute for Food and Drug Control,Suzhou 215104, China;2.Suzhou Hospital of Traditional Chinese Medicine,Suzhou 215006,China;3.College of Pharmacy, Nanjing University of Chinese Medicine,Nanjing 210046,China)

ObjectiveTo authenticateEuryales semencollected from seventeen regions by NIR fingerprint spectra and to establish a rapid analysismethod.MethodsSpectrawere collected by VARIAN CARY5000 ultraviolet visible near infrared spectrophotometer,with correlation and origin clustering method for analysis by using Origin 7.5 and SPSS 18.0 software.ResultsThe correlation of peaks forEuryales semenfrom 17 localities were significant,while the regions were distinguished clearly.ConclusionIt is indicated that the method is rapid,lossless,and it can be applied to authenticateEuryalesfrom different regions,which provides reference to rapid inspection of Chinese medicines.

Euryales semen;Near-infrared spectroscopy;Analysis,rapid

R282.71;R927

A

1004-0781(2014)05-0653-05

2013-06-24

2013-08-23

*“十二五”國家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2011BAI04B06)

陳蓉(1986-),女,江蘇蘇州人,中藥師,碩士,研究方向:中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)。電話:(0)13962513952,E-mail:kedingyu@126.com。

吳啟南(1963-),男,江蘇南通人,教授,博士,研究方向:中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)。電話:025-85811507,E-mail:qnlxw@yahoo.com.cn。