小鼠卵巢組織冷凍保存方法對組織內(nèi)分泌功能的影響

朱夏琴，孫正怡，郁琦，甄璟然，王雪，何方方

（中國醫(yī)學科學院，北京協(xié)和醫(yī)學院，北京協(xié)和醫(yī)院婦產(chǎn)科，北京 100730）

腫瘤放化療的性腺毒性是女性腫瘤患者生殖內(nèi)分泌功能喪失的主要原因，隨著腫瘤治愈率及生存率的提高，女性腫瘤患者的生育問題得到關(guān)注。卵巢組織獲取相對容易，且卵巢組織冷凍復蘇后除可以重建患者的內(nèi)分泌功能外，還可能獲得生育能力，因此卵巢組織冷凍復蘇在臨床上具有重要的應用前景。目前卵巢組織冷凍多采用慢速冷凍，玻璃化冷凍作為近期發(fā)展起來的新技術(shù)，與慢速冷凍相比，不需要冷凍儀器、耗時更短，且本中心將玻璃化冷凍應用于卵裂球及囊胚凍存，其復蘇后的胚胎存活率及臨床妊娠率均處于國內(nèi)領(lǐng)先水平，我們前期的研究也顯示玻璃化冷凍可以較好地保存卵巢組織［1］。因此本實驗在既有的研究基礎之上，進一步評價不同的冷凍保存方法對卵巢組織內(nèi)分泌功能的影響。

材料和方法

一、實驗動物

由北京協(xié)和醫(yī)院動物實驗中心提供，6周齡ICR雌鼠，體重25～28g。經(jīng)動物中心培養(yǎng)1周后，行陰道脫落上皮涂片觀察小鼠動情周期，選擇動情周期正常的25只ICR雌鼠。

二、卵巢組織的獲取與預處理

頸椎脫臼法處死ICR雌鼠，從下腹正中切口處獲取雙側(cè)卵巢，放入經(jīng)羥乙基哌嗪乙硫磺酸（HEPES）緩沖的擬人輸卵管液（HTF）（Sage，美國）試管內(nèi)，夾于冰間，送回實驗室。37℃熱臺上用1ml針頭的切割面剔去卵巢血管結(jié)締組織，并將卵巢組織切成小塊，每塊大小約為1mm×1mm×1mm。操作于含有HEPES-HTF培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿中進行。根據(jù)不同的冷凍方法，將卵巢組織隨機分為5組，每組5例：新鮮對照組、二甲亞砜（DMSO）慢速冷凍組（A組）、丙二醇（PROH）慢速冷凍組（B組）、冷凍管玻璃化冷凍5min組（C組）及冷凍管玻璃化冷凍8min組（D組）。

三、冷凍復蘇方案

實驗所用試劑除標注外均購自美國Sigma公司。冷凍基礎液為含5mg／ml人血清白蛋白（HSA，Sage，美國）的 HEPES-HTF。

1．慢速冷凍方案：冷凍基礎液加入1．5mol／L DMSO（A組）或PROH（B組）作為冷凍保護液1，冷凍基礎液中加入1．5mol／L DMSO（A 組）或PROH（B組）＋0．1mol／L蔗糖作為冷凍保護液2。

卵巢組織在含有冷凍保護液1的培養(yǎng)皿中停留5min，裝入含1．8ml冷凍保護液2的冷凍管（Nunclon，丹麥），4℃冰箱平衡30min。放入程序冷凍儀。

自4℃開始以2℃／min的速度降溫至－8℃，－8℃維持10min，人工植冰后再維持10min；以0．3℃／min的速度降溫至－40℃；以－30℃／min的速度降溫至－150℃后投入液氮。

2．玻璃化冷凍方案：冷凍基礎液中加入7．5%（體積／體積，v／v）DMSO 及 7．5% （v／v）乙二醇（EG）作為預平衡液；冷凍基礎液中加入15%（v／v）DMSO＋15%（v／v）EG＋5．8mg／ml聚蔗糖（Ficoll 400）＋0．58mol／L蔗糖作為玻璃化液。

卵巢組織在含有預平衡液的培養(yǎng)皿中停留5min（C組）或8min（D組），轉(zhuǎn)移至含有玻璃化液的培養(yǎng)皿中停留5min（C組）或8min（D組），迅速轉(zhuǎn)移至含有液氮的冷凍管中后投入液氮。

3．復蘇方案：卵巢組織凍存2～10d后復蘇。將含有卵巢組織的冷凍管自液氮中取出，在空氣中停留5～10s后，于37℃水浴解凍至肉眼所見冰晶溶解。分別投入含有0．67、0．33、0．2、0mol／L蔗糖的復蘇液中，充分洗滌，平衡5min；最后移入添加了5%HSA的HTF中，放入5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

四、冷凍復蘇后卵巢組織的培養(yǎng)

Transwell-24孔板（Corning，美國），隔孔放入一個嵌入式小室，每個小室底部鋪100μl經(jīng)α－最低必需培養(yǎng)基（α-MEM）以3∶1稀釋的 matrigel膠（BD，美國），待膠凝固后小室內(nèi)放入卵巢組織兩枚，加入培養(yǎng)液150μl，小室外室加入培養(yǎng)液650μl。培養(yǎng)液成分為α-MEM（中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學細胞 中 心）中 加 入 50ml／l HSA、10ml／l ITS（10μg／ml胰島素、5．5μg／ml轉(zhuǎn)鐵蛋白和5．0ng／ml亞硒酸）、0．5U／ml人絕經(jīng)期促性腺激素（HMG，麗珠醫(yī)藥）、100U／ml青霉素和100μg／ml鏈霉素（中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學細胞中心）。在37℃5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14d。隔天從外室吸出培養(yǎng)液500μl裝入eppendorf試管內(nèi)，－80℃保存至分析用；并同時補充入等量新鮮培養(yǎng)液。

五、卵巢組織冷凍復蘇后行小鼠腎包膜下移植

冷凍復蘇方案同上。復蘇后卵巢組織放入5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，然后經(jīng)背部切口將卵巢組織塊移植入ICR小鼠腎包膜下，左右各移植2塊，移植同時去除受體鼠卵巢。為提高可比性，增加了未處理的自然對照組，以及去除卵巢后未移植卵巢組織的去勢未移植對照組。移植了卵巢組織的受體ICR小鼠常規(guī)飼養(yǎng)2周后，取血測定血清E2水平，比較各組間的差異。

六、E2水平的檢測

體外培養(yǎng)隔天收集的培養(yǎng)液及移植小鼠的血清統(tǒng)一采用化學免疫發(fā)光法測定E2水平。試劑盒由Beckman Coulter（美國）提供，檢測按說明書要求進行，數(shù)值超出檢測上限時行α-MEM稀釋后檢測。

七、統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)采用SPSS 17．0軟件進行統(tǒng)計。培養(yǎng)液及血清E2值各組比較分別采用重復測量數(shù)據(jù)方差分析及單因素方差分析。P＜0．05表示差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

一、各組體外培養(yǎng)液中E2濃度

體外培養(yǎng)14d，各組培養(yǎng)液中E2水平隨培養(yǎng)時間逐漸增加（F＝14．146，P＜0．001）。同一天的E2水平比較，A組、B組顯著高于對照組、C組及D組（P＜0．05），A組與B組之間無顯著性差異，對照組、C組及D組之間無顯著性差異（P＞0．05）（表1）。

二、復蘇移植常規(guī)飼養(yǎng)14d后受體小鼠血清E2濃度

新鮮對照組及各實驗組冷凍復蘇后移植入同種異體小鼠，14d后，比較各組小鼠血清E2平均水平，DMSO慢速冷凍復蘇移植組、PROH慢速冷凍復蘇移植組的平均E2水平顯著高于其他各組（P＜0．05）；新鮮移植對照組、玻璃化5min復蘇移植組、玻璃化8min復蘇移植組及去勢未移植對照組的平均E2水平顯著低于未處理的自然對照組（P＜0．05）；新鮮移植對照組、玻璃化5min復蘇移植組、玻璃化8min復蘇移植組比較，E2水平無顯著性差異（P＞0．05）（表2）。

表1 體外培養(yǎng)各組培養(yǎng)液中E2濃度（±s）

表1 體外培養(yǎng)各組培養(yǎng)液中E2濃度（±s）

注：與對照組、C組及D組比較，＊P＜0．05

組 別 例數(shù)培養(yǎng)液中 E2 濃度（pmol／L）第2天 第4天 第6天 第8天新鮮對照組 10 283．98±8．42 405．53±13．09 690．69±31．87 1 269．45±210．02 A組 10 381．68±11．08＊ 914．93±47．95＊ 1 915．37±265．39＊ 5 420．59±369．20＊B組 10 298．77±6．97＊ 456．55±13．89＊ 996．04±189．26＊ 3 937．91±279．34＊C組 10 176．01±6．23 185．34±10．81 222．18±9．91 234．99±8．25 D組 10 175．83±7．83 179．90±8．75 183．06±4．38 187．32±5．76組 別 例數(shù)培養(yǎng)液中E2 濃度（pmol／L）第10天 第12天 第14天新鮮對照組 10 3 089．77±298．89 5 262．78±371．39 7 721．68±5 10 231．94±7．90 287．10±10．01 474．16±25．94 72．28 A組 10 13 223．01±1 128．06＊ 20 944．69±1 929．89＊ 24 970．68±2 019．27＊B組 10 11 241．21±992．36＊ 23 954．09±1 893．45＊ 28 196．61±2 001．03＊C組 10 376．91±10．47 617．29±40．92 1 521．58±390．79 D組

表2 復蘇移植各組第14天小鼠血清E2水平比較（±s）

表2 復蘇移植各組第14天小鼠血清E2水平比較（±s）

注：與其他各組比較，＊P＜0．05；與未處理的自然對照組比較，＊＊P＜0．05

組 別 例數(shù) 血清E2水平（pmol／L）新鮮組織移植對照組 5 30．06±5．38＊＊DMSO慢速冷凍復蘇移植組 5 132．38±10．73＊PROH慢速冷凍復蘇移植組 5 142．95±11．09＊玻璃化5min復蘇移植組 5 27．01±3．91＊＊玻璃化8min復蘇移植組 5 34．68±5．93＊＊未處理的自然對照組 5 43．09±8．64去勢未移植對照組 5 19．63±2．85＊＊

討 論

女性腫瘤患者經(jīng)過手術(shù)或放化療后生殖功能必然受到影響，在性腺功能受損前進行卵巢組織的冷凍適合于青春期前卵泡尚未發(fā)育成熟的患者、不能延誤腫瘤治療以及促排卵有禁忌或者有切除雙側(cè)附件風險的女性患者［2］。目前卵巢組織的冷凍保存尚處于研究階段。

卵巢皮質(zhì)內(nèi)具有大量的卵泡儲備，原始卵泡因體積小、代謝率低等特征能夠耐受低溫損傷，在皮質(zhì)冷凍中可以相對多地完好保存［3］。冷凍方法根據(jù)降溫方式的不同可以分為慢速冷凍和玻璃化冷凍。慢速冷凍是傳統(tǒng)的冷凍方法，采用低濃度的冷凍保護劑以降低細胞毒性；玻璃化冷凍因為降溫迅速，組織或細胞與冷凍劑接觸時間短，則需要更高濃度的冷凍保護劑和更快的降溫速率。目前卵巢組織的冷凍方案尚無統(tǒng)一意見，但多數(shù)采用慢速冷凍并取得了一定的臨床活產(chǎn)［4］。玻璃化冷凍因其較好的胚胎／卵母細胞存活率、操作耗時短、無需特殊儀器等特點逐漸受到青睞，也逐步應用至卵巢組織冷凍的研究中［4］。本中心玻璃化冷凍囊胚、卵母細胞的存活率較高［5］，有較為成熟的臨床操作方案，因此，本研究比較現(xiàn)有的玻璃化冷凍方案用于卵巢組織冷凍相對于慢速冷凍的效果。

目前的研究顯示，慢速冷凍與玻璃化冷凍對卵巢組織保存效果的結(jié)果不盡一致：部分研究結(jié)果顯示慢速冷凍相對于玻璃化冷凍可以更好地保存卵泡；部分研究結(jié)果則相反。冷凍保護劑的選擇、組織塊的大小、降溫速率以及冷凍工具的選擇等是導致結(jié)果不同的主要因素。比如玻璃化冷凍采取了多種不同的改良：直接投入液氮、冷凍管、固相表面等方法。慢速冷凍多數(shù)采用DMSO或者PROH作為冷凍保護劑；最早Gosden等［6］采用DMSO進行羊的卵巢組織冷凍，自體移植后分娩了小羊；其后的多數(shù)研究表明DMSO的慢速冷凍可以保存竇前卵泡，移植后B超監(jiān)測顯示有卵泡的生長發(fā)育［7］。Castro等［8］的研究發(fā)現(xiàn)，DMSO與蔗糖加或不加血清都可以在體外培養(yǎng)中見到較好的卵泡生長。PROH因其用于卵母細胞和胚胎的冷凍效果滿意，此后被應用至慢速冷凍的研究。研究發(fā)現(xiàn)，PROH除可保存卵泡外，對前顆粒細胞的保存也有較好的效果。Fabbri等［9］的研究表明相對低的PROH與蔗糖可以獲得較好的慢速冷凍效果。本實驗中分別采用DMSO和PROH作為冷凍保護劑進行慢速冷凍，結(jié)果顯示均能較好地維持組織粒的內(nèi)分泌功能，統(tǒng)計學分析無顯著性差異。

玻璃化冷凍因保護劑的濃度高，常聯(lián)合采用多種保護劑以降低毒性損傷，因此各中心根據(jù)自己的條件所采用的冷凍方案各有區(qū)別，冷凍效果也有所差異［10］。近期的研究認為針灸針的應用可以獲得更好的玻璃化冷凍效果［11］。玻璃管冷凍是囊胚玻璃化冷凍的演變，直接將經(jīng)預平衡液和玻璃化液兩步平衡好的組織投入玻璃管中，迅速降溫，以期達到玻璃化的狀態(tài)，更好地保護卵巢組織。整個操作耗時短，因此本實驗希望能夠通過對卵巢組織塊大小、冷凍、復蘇液中保護劑的濃度以及平衡時間的調(diào)整，摸索合適的冷凍方案。結(jié)果顯示，兩步平衡作用時間5min和8min相比，差異無統(tǒng)計學意義；無論是體外培養(yǎng)液還是同種移植小鼠血清E2水平比較，結(jié)果均提示本實驗中的兩種冷凍方法復蘇后的卵巢組織均具有內(nèi)分泌功能，且慢速冷凍效果可能優(yōu)于玻璃化冷凍效果。

體外培養(yǎng)通過構(gòu)建合適的氣體濃度和營養(yǎng)物質(zhì)，提供卵巢組織體外生長的條件，并可通過培養(yǎng)液中的激素檢測分析、評價組織的內(nèi)分泌功能［12］。研究顯示，體外培養(yǎng)卵巢組織的E2分泌與卵泡直徑的大小相關(guān)［13］。本實驗中，體外培養(yǎng)液未添加E2合成相關(guān)物質(zhì)，而培養(yǎng)液中E2水平在各組14d中均呈現(xiàn)出持續(xù)上升的趨勢，提示在培養(yǎng)過程中，原始卵泡可向初級卵泡發(fā)育，且不僅原始卵泡在冷凍過程中可以被保存，部分初級卵泡也可以一定程度地被保存。因培養(yǎng)時間相對較短，原卵巢組織中的前體物質(zhì)可提供E2的合成原料。本實驗中幾種冷凍方法與新鮮對照組比較，無顯著性差異。

卵巢組織的移植可分為同種自體移植、同種異體移植和異種移植；根據(jù)移植部位的不同可分為原位移植和異位移植。動物實驗中，裸鼠的移植部位常選擇皮下、肌肉或腹腔；其他移植部位包括腎包膜下等，這些部位移植均獲得較好的生長情況［14－15］。腎包膜提供了相對表淺的移植位置，且貼近腎組織，血供相對豐富；但手術(shù)操作亦容易引起腎出血。研究表明，即使卵泡數(shù)有所下降，移植后的卵巢組織仍具有良好的分泌激素的功能［15］。本實驗中，血清E2水平也提示卵巢組織具有分泌活性，其中慢速冷凍血清E2水平高于玻璃化冷凍組，提示慢速冷凍組對卵泡保存的效果優(yōu)于冷凍管玻璃化冷凍組，這一趨勢與前期研究結(jié)果類似［1］。慢速冷凍因降溫過程中細胞內(nèi)冰晶形成、物理損傷及冷凍保護劑的細胞毒性等對組織／細胞有一定程度損傷；但本實驗中慢速冷凍復蘇組培養(yǎng)液及移植組血清E2水平高于新鮮對照組，這一結(jié)果難以用單一的冷凍損傷解釋，可能與冷凍過程中，部分具有分泌功能的生長卵泡受到冷凍損傷，原本合成、未來得及分泌的E2進入培養(yǎng)液／血液；以及移植后這部分不完全受損的卵泡逐漸恢復分泌功能，與由原始卵泡發(fā)育而來的卵泡共同作用，顯示出持續(xù)的較高E2水平；以及本實驗樣本量較少，存在一定不可避免的偏倚有關(guān)。其具體原因尚需要進一步的研究驗證。

本研究結(jié)果提示慢速冷凍與玻璃化冷凍復蘇后的卵巢組織具有一定內(nèi)分泌能力，慢速冷凍效果可能優(yōu)于玻璃化冷凍。同種移植實驗成功為進一步獲卵等操作提供了可行性。實際操作中可根據(jù)不同的條件和要求選擇適當?shù)睦鋬龇椒?，且可以對冷凍方法進行改進，以獲得更好的冷凍保存效果。但本實驗樣本量較少，且培養(yǎng)液或血清E2水平僅僅是卵巢組織功能的一方面體現(xiàn)，日后的研究應該完善樣本總量并結(jié)合其他指標綜合評價冷凍效果。

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