傳統(tǒng)發(fā)酵霉豆渣中產(chǎn)酶優(yōu)勢菌的分離鑒定及性質(zhì)研究

徐書澤，黃麗，滕建文，韋保耀，夏寧

(廣西大學(xué)輕工與食品工程學(xué)院，廣西南寧，530004)

霉豆渣是我國典型的傳統(tǒng)發(fā)酵產(chǎn)品，是以豆渣為原料經(jīng)自然發(fā)酵而成的一種食品，主要分布在湖北武漢，江西會昌以及廣西梧州等地［1］。其中梧州霉渣是梧州著名小吃，已有幾百年歷史，成品以切口色白、粘實、爽手、富有彈性、表面霉色均勻呈粉紅色為上乘［2］。煮熟爽口，有一股獨特的香味，被港澳稱為廣西豬肝。

豆渣除含有豐富的膳食纖維，還有蛋白質(zhì)、脂肪、異黃酮和維生素等，具有豐富的營養(yǎng)價值［3－5］，通過微生物發(fā)酵，可以把其中不溶性高分子化合物分解成可溶性低分子化合物，并能去除大豆的苦澀、豆腥味和一些有害物質(zhì)，粗纖維顆粒微細(xì)化，并因這些分解產(chǎn)物的重新組合和微生物的自溶作用產(chǎn)生了豆渣中原來沒有的營養(yǎng)成分，最終產(chǎn)品中的游離氨基酸、水溶性礦物質(zhì)、水溶性固形物、維生素等顯著提高，使豆渣中營養(yǎng)成份被利用的實際可能性大大提高［6－7］。

目前霉豆渣的制作主要采用自然發(fā)酵的方式，這種制作方式發(fā)酵周期長，易受到雜菌的污染，使產(chǎn)品的品質(zhì)不穩(wěn)定，安全得不到保障。而且受到環(huán)境溫度，濕度等條件的影響，具有季節(jié)及地域限制。因此篩選合適的菌種在無菌的條件采用菌種直接進(jìn)行發(fā)酵既可做到衛(wèi)生安全又可縮短發(fā)酵周期滿足工業(yè)化生產(chǎn)的要求。目前已有學(xué)者從武漢，江西等地的霉豆渣中分離出毛霉屬，串珠霉屬，根霉屬，枯草芽孢桿菌及運動發(fā)酵單胞菌和雅致放射毛霉等主要發(fā)酵菌株［1，8］。張燕鵬［9］等對江西的豆渣菌進(jìn)行了菌相分析，結(jié)果表明豆渣菌是以真菌和細(xì)菌為主的混合型發(fā)酵食品。真菌主要為串珠霉屬、根霉屬和酵母屬;細(xì)菌主要為球菌屬、腸桿菌屬，非乳桿菌屬和3株枯草芽孢桿菌。周彥良［8］將分離得到的雅致放射毛霉和運動發(fā)酵單胞菌反接種于豆渣中，優(yōu)化了發(fā)酵條件，表明純菌種混合發(fā)酵生產(chǎn)霉豆渣是可行的，能形成與自然發(fā)酵相似的品質(zhì)，且可以縮短發(fā)酵時間，避免非目標(biāo)微生物的污染。目前還沒有關(guān)于梧州霉豆渣發(fā)酵菌種的相關(guān)報道，且由于自然發(fā)酵霉豆渣的發(fā)酵菌株及感官品質(zhì)受地域影響，故本文以梧州霉豆渣為研究對象，以期從中篩選出具有較好產(chǎn)酶性的優(yōu)勢菌種。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

霉豆渣，購于廣西梧州農(nóng)貿(mào)市場;

培養(yǎng)基:YPD培養(yǎng)基、孟加拉紅培養(yǎng)基、平板計數(shù)培養(yǎng)基、馬鈴薯液體培養(yǎng)基、酪素培養(yǎng)基、羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基。

1.2 儀器及設(shè)備

電熱鼓風(fēng)干燥箱、壓力蒸汽滅菌鍋、培養(yǎng)箱、超凈工作臺、光學(xué)顯微鏡、電子天平。

1.3 樣品的處理［10］

在超凈工作臺上稱取霉豆渣樣品25 g，研磨，加入含有225 mL滅菌生理鹽水的三角瓶中，浸泡、振搖30 min后，制成樣品菌液備用。

1.4 微生物的分離純化［10］

樣品菌液經(jīng)適當(dāng)稀釋后取0.1 mL涂平板，細(xì)菌分離采用平板計數(shù)瓊脂培養(yǎng)基，置于37℃下培養(yǎng)24 h，霉菌和酵母菌分別采用YPD和孟加拉紅培養(yǎng)基，置于28℃下培養(yǎng)72 h。微生物長出單菌落后再反復(fù)進(jìn)行平板劃線分離，直至得到純菌株。

1.5 產(chǎn)酶菌株的篩選

1.5.1 蛋白酶產(chǎn)生菌的確定［11］

將從樣品中分離出的菌株接種到酪素培養(yǎng)基平板上，在適宜溫度下培養(yǎng)2 d。測定各菌株的透明圈直徑(H)和的菌落直徑(C)，并計算出每1菌株的H/C值。此值越高，表明蛋白酶活越高。

1.5.2 纖維素酶產(chǎn)生菌的確定［12］

把挑選到的菌株點接到羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基上，放在適宜的溫度下培養(yǎng)2 d，向培養(yǎng)基中加入適量的1 mg/mL剛果紅溶液，染色1h，棄去染液后，加入適量1 mol/L的NaCl溶液，洗滌1 h，通過觀察菌落周圍清晰的透明圈來判定產(chǎn)纖維素酶的活力。

1.6 發(fā)酵試驗

將上述篩選得到的菌種反接種于豆渣中，觀察菌株的生長情況，通過豆渣的外觀及感官特性挑選出發(fā)酵豆渣質(zhì)量最好的菌株進(jìn)行鑒定。

1.7 發(fā)酵菌種的鑒定

霉菌菌落觀察和鑒定:對分離的霉菌進(jìn)行點植培養(yǎng)觀察其菌落特征，并于顯微鏡下觀察其顯微結(jié)構(gòu)。通過對菌落和菌體形態(tài)及菌絲產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)的觀察，并參考《常見與常用真菌》［13］和《真菌鑒定手冊》［14］進(jìn)行鑒定。

1.7.1 DNA提取

真菌DNA的提取采用CTAB法［15］:稱菌絲0.1 g放入研缽中，并加入0.1 g石英砂迅速研磨粉碎。用3 mL CTAB抽提液洗滌粉末，轉(zhuǎn)入10 mL滅菌離心管中，65℃水浴30 min，冷卻至室溫，加入與上清等體積的氯仿∶苯酚(體積比(1∶1)，混勻，室溫下，10 000×g離心10 min，轉(zhuǎn)移上清入新的10 mL滅菌離心管中，加入與上清液等體積的氯仿∶異戊醇(體積比24∶1，v/v)，混勻，4℃條件下，10 000×g離心10 min，轉(zhuǎn)移上清入新的10 mL滅菌離心管中加入與之等體積的異丙醇，輕輕混勻后放入－20℃冰箱至少1 h以沉淀DNA。然后4℃下10 000×g離心10 min，棄上清液，用冰冷的70%乙醇溶液洗滌沉淀，4℃下10 000×g離心10 min，重復(fù)2次。棄去上清液后室溫風(fēng)干DNA，加入0.2 mL TE溶解DNA及20 μg/mL RNase于37℃溫育30 min以消除RNA。

1.7.2 PCR擴增

選用真菌引物序列，其編號和序列:ITS1(5’TCCGTAGGTGAACCTGCGG 3’)ITS4(5’TCCTCCGCTTATTGATATGC 3’)。PCR 反應(yīng)體系(25 μL):Template:1 μL;Primer up(10 μmol/L):0.5 μL;Primer down(10 μmol/L):0.5 μL;2 × Taq PCR Master mix:12.5 μL，加水至 25 μL。PCR 程序設(shè)定:預(yù)變性94℃ 5 mim;循環(huán) 94 ℃ 30 s，55 ℃ 35 s，72 ℃1 min，35 個循環(huán);延伸 8 min。

1.7.3 測序及比對，構(gòu)建進(jìn)化樹

將PCR產(chǎn)物送到上海生工測序，將測序得到的序列提交到Genbank，通過blast比對，找到同源性高的菌種進(jìn)行鑒定。

1.8 菌種生理特征的研究

采用直接干燥法:將振蕩培養(yǎng)獲得的培養(yǎng)物用預(yù)先測定干重的定性濾紙濾得菌體后，水洗2次，然后在連同濾紙一起在105℃下烘干至恒重，測質(zhì)量，從而算出菌體干重［16］。

1.8.1 菌種最適培養(yǎng)時間的測定

取1 mL孢子懸浮液接種到馬鈴薯液體培養(yǎng)基中，在28 ℃、150 r/min 下分別培養(yǎng)12、24、36、48、60、72 h后取出，用事先稱量過的濾紙過濾，然后將濾餅在105℃下干燥至恒重，測質(zhì)量，以菌絲體干重作為菌種生物量的指標(biāo)，單位為g/100 mL發(fā)酵液。每組為2個平行樣，測量后取平均值。

1.8.2 菌種最適生長溫度的測定

取1 mL孢子懸浮液接種到馬鈴薯液體培養(yǎng)基中，分別置于16、20、24、28、32 ℃的培養(yǎng)箱中，在 150 r/min下恒溫振蕩培養(yǎng)48 h后取出，用事先稱量過的濾紙過濾，然后將濾餅在105℃干燥至恒重，測質(zhì)量，以菌絲體干重作為菌種生物量的指標(biāo)，單位為g/100 mL發(fā)酵液。每組為2個平行樣，測量后取平均值。

1.8.3 菌種最適生長pH的測定

取lmL孢子懸浮液接種到不同pH值3、4、5、6、7的馬鈴薯液體培養(yǎng)基中，在28℃、150 r/min下培養(yǎng)48 h后取出，用事先稱量過的濾紙過濾，然后將濾餅在105℃下干燥至恒重，測其質(zhì)量，以菌絲體干重作為菌種生物量的指標(biāo)，單位為g/100 mL發(fā)酵液。每組為2個平行樣，測量后取平均值。

2 結(jié)果與討論

2.1 微生物的分離和產(chǎn)酶菌種的篩選

通過平板劃線法共得到8株細(xì)菌，4株酵母，2株霉菌。因為豆渣中富含膳食纖維，占豆渣干重的50%以上，但由于纖維素含量高、纖維顆粒大，其口感粗糙，將纖維素適當(dāng)降解，對提高可溶性膳食纖維和改善豆渣的口感都有重要的意義。因此，篩選出產(chǎn)蛋白酶和纖維素酶的菌株對豆渣發(fā)酵工藝的研究有著重要意義。表1表明，細(xì)菌中 X5，X6，X7產(chǎn)生蛋白酶，透明圈和菌與菌落直徑之比依次為1.6、2.8、1.8。產(chǎn)生纖維素酶的有1株酵母J4和1株霉菌M1，而既能產(chǎn)生蛋白酶又能產(chǎn)生纖維素酶的僅有霉菌M1。

表1 分離菌株的蛋白酶和纖維素酶活力Table 1 The proteolytic and cellulose activity of the strain

2.2 發(fā)酵試驗

將上述分離得到的菌株進(jìn)行反接種實驗，將其接種于豆渣中，于28℃培養(yǎng)3～5 d，結(jié)果只有霉菌M1可以將豆渣發(fā)酵形成與霉豆渣相似的感官品質(zhì)，其外表覆蓋一層橘黃色孢子，質(zhì)構(gòu)緊密，且在發(fā)酵過程中有特殊香氣形成。與傳統(tǒng)發(fā)酵的霉豆渣相比，顏色更加均勻鮮艷。接種其他菌株無法形成該種特征，在發(fā)酵后期有異味產(chǎn)生。原料豆渣與霉菌M1發(fā)酵后的豆渣的感官形態(tài)如圖1所示。

2.3 菌株鑒定

2.3.1 形態(tài)鑒定

將分離得到的霉菌M1接種于PDA培養(yǎng)基，菌落絨毛狀，覆蓋整個培養(yǎng)皿，呈蔓延生長，菌絲開始為白色，后變?yōu)辄S色，菌叢直立，平皿邊緣會有大量橘黃色孢子生成。斜面培養(yǎng)時靠近試管口生長良好，會堆積橙橘黃的的孢子環(huán)。將其置于顯微鏡下觀察，菌絲有分支和橫隔，無假根，孢子呈一節(jié)一節(jié)的橢圓狀或方形，分生孢子為單細(xì)胞，呈橘黃色。通過其生理形態(tài)可以確定該菌為脈孢菌屬。

圖1 原料及發(fā)酵豆渣Fig.1 Fermented bean curd

2.3.2 PCR產(chǎn)物電泳圖譜

PCR產(chǎn)物電泳圖譜如圖2所示。

圖2 PCR產(chǎn)物電泳圖譜Fig.2 PCR electrophoretogram

2.3.3 分子鑒定

將得到的測序結(jié)果提交到blast與NCBI收錄的DNA序列進(jìn)行比對，經(jīng)核酸同源性分析，該菌與Neurospora crassa的同源性達(dá)到99%，將同源性97%以上的菌株構(gòu)建進(jìn)化樹，如圖3所示。

圖3 分子進(jìn)化樹Fig.3 Molecular phylogenetic tree

結(jié)果表明該菌株 Neurospora sp.與Neurospora crassa的在同一支上，結(jié)合形態(tài)學(xué)鑒定可確定該菌為粗糙脈孢菌。

2.4 菌種生理特性的研究

2.4.1 不同培養(yǎng)時間下菌種生長量變化

在馬鈴薯液體培養(yǎng)基上(100 mL/瓶)接入孢子懸浮液后，在28℃，150 r/min條件下振蕩培養(yǎng)，每隔12 h取出2瓶，過濾菌絲體，測其干重，求其平均值。由圖4可知，該菌在馬鈴薯培養(yǎng)基的對數(shù)生長期大約在0～36 h，穩(wěn)定期大約在36～60 h，之后屬于衰退期。

圖4 不同培養(yǎng)時間下菌種生長量變化Fig.4 Effect of time on the strain growth

2.4.2 不同pH值條件下菌種生長量變化

將孢子懸浮液接種到不同 pH 值 3、4、5、6、7的馬鈴薯液體培養(yǎng)基中，在28℃、150 r/min下培養(yǎng)48 h取出，過濾菌絲體，測其干重，求其平均值。由圖5可知在pH值為3時該菌生長受到抑制，且在馬鈴薯液體培養(yǎng)基中形成的菌體成顆粒狀，在pH值4～8均可生長，但是在pH值為6時生長量最大，生長情況最好，所以該菌的最適生長pH值為6。

圖5 pH值對菌種生長量的影響Fig.5 Effect of pH on the strain growth

2.4.3 不同培養(yǎng)溫度下菌種生長情況

不同培養(yǎng)溫度下菌種生長情況見表2。

表2 培養(yǎng)溫度對菌種生長的影響Table 2 Effect of temperature on the strain growth

本試驗是在PDA固體培養(yǎng)基上接種培養(yǎng)，在18、24℃下，該菌生長緩慢，24 h后24℃下有少量白色菌長出，但菌絲很少，40 h后18℃的才有生長，而且在后期的培養(yǎng)過程中這2種溫度下的菌的菌絲生長都不多，但會有孢子生成。但是在28、32、36℃下培養(yǎng)時12 h就有菌體生長，18 h菌絲較多，但是36℃條件下的菌絲開始變橙色。40 h后，菌絲生長得多而密，生成孢子，但36℃下的孢子更多，菌絲生長情況以32℃的最好。

3 結(jié)語

本文通過傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)從梧州霉豆渣中分離得到1株產(chǎn)酶優(yōu)勢菌，利用形態(tài)學(xué)和分子手段鑒定為粗糙脈孢菌，該菌能產(chǎn)生蛋白酶和纖維素酶，可以發(fā)酵豆渣。并且進(jìn)一步研究了該菌的最適生長溫度，時間以及pH值，為脈孢菌發(fā)酵豆渣工藝的研究奠定了一定的理論基礎(chǔ)。

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