不同生長階段保加利亞乳桿菌關(guān)鍵蛋白酶基因表達(dá)變化規(guī)律*

韓巍巍，侯俊財，曹秋閣，高夢妮，張佳秀，吳瑤，李曉靜

1(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品科學(xué)教育部重點實驗室，黑龍江哈爾濱，150030)2(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 哈爾濱，150030)

保加利亞乳桿菌(Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus)是革蘭氏陽性、兼性厭氧、同型乳酸發(fā)酵的乳酸菌，是發(fā)酵酸奶的典型發(fā)酵劑［1］。保加利亞乳桿菌對營養(yǎng)需求比較苛刻，不能同化無機(jī)氮源，因此，為了保證保加利亞乳桿菌在乳中的營養(yǎng)需求，必須依靠其有效的蛋白水解酶系作用酪蛋白基質(zhì)產(chǎn)生短肽和釋放游離氨基酸［2］。研究表明，保加利亞乳桿菌菌株間的蛋白水解活力存在較大差異［3］。保加利亞乳桿菌高效復(fù)雜的蛋白水解酶系主要由3部分組成:將酪蛋白降解成大分子多肽的細(xì)胞壁結(jié)合蛋白酶(PrtB);轉(zhuǎn)運氨基酸和多肽穿過細(xì)胞質(zhì)膜的肽轉(zhuǎn)運體系(Opp、Dpp和DtpT轉(zhuǎn)運體系);進(jìn)一步降解多肽形成短肽和氨基酸的胞內(nèi)肽酶［4－5］。目前，保加利亞乳桿菌的蛋白水解體系中部分相關(guān)酶的基因已被檢出，國內(nèi)外學(xué)者多利用分子技術(shù)研究這些基因在轉(zhuǎn)錄水平上表達(dá)的變化規(guī)律［2，6］。與乳酸乳球菌和瑞士乳桿菌相比，對保加利亞乳桿菌的蛋白水解酶系相關(guān)酶基因表達(dá)量的研究較少［7］，尤其國內(nèi)少有報道，本文旨在mRNA轉(zhuǎn)錄水平上，應(yīng)用實時熒光定量PCR技術(shù)，探討保加利亞乳桿菌的蛋白水解體系中關(guān)鍵蛋白酶基因(prtB、oppD、pepC、pepF、pepQ、pepX、pepT)在菌體不同生長階段表達(dá)規(guī)律。

1 材料與方法

1.1 菌株、試劑及設(shè)備

菌株:德氏乳桿菌保加利亞亞種(Lactobacillus debreuckii ssp.bulgaricus)KLDS 1.0207、1.0501、1.1007、1.9201、1.9203、1.0208 由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品科學(xué)教育部重點實驗室分離保藏。

主要試劑:復(fù)原脫脂乳(新西蘭)、EDTA·2Na(Amresco)、鄰苯二甲醛(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)、DEPC(科爾生物有限公司)、RNAprep pure培養(yǎng)細(xì)菌總RNA提取試劑盒(天根生化科技北京有限公司)、PrimerScript? RT反轉(zhuǎn)錄試劑盒(寶生物大連工程有限公司)、SYBR? Premix Ex TaqTM試劑盒(寶生物大連工程有限公司)。

主要設(shè)備:離心機(jī)，上海安亨科學(xué)儀器廠;PCR儀，杭州博日科技有限公司;電泳儀，北京市六一儀器廠;紫外分光光度計，Japan;實時定量PCR儀，英濰捷基上海貿(mào)易有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 保加利亞乳桿菌的生長曲線

菌株2%接種于MRS液體培養(yǎng)基中，37℃活化3代，然后用12%滅菌脫脂乳37℃?zhèn)鞔?次，充分恢復(fù)菌株蛋白水解活力，保藏4℃?zhèn)溆?。將活化后的菌種2%接入滅菌脫脂乳，37℃培養(yǎng)。每隔2h取樣測定生物量和pH值，獲得生長曲線和pH變化曲線。

生物量的測定:取0.5 mL培養(yǎng)物，加入4.5 mL 0.2%的EDTA·2Na，漩渦混勻，以12%的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至12，漩渦混合后，波長410 nm處測定吸光值，空白對照為未接菌的滅菌脫脂乳。每組3次重復(fù)［8］。采用pH計測定pH值。

1.2.2 保加利亞乳桿菌蛋白水解活力的測定

菌株的蛋白水解活力測定參考 Church［9］的鄰苯二甲醛(OPA)方法。

將活化好的菌株按2%接種于滅菌脫脂乳中，37℃培養(yǎng)。每隔2 h取樣品2 mL，加入4 mL 0.75 mol/L三氯乙酸溶液，漩渦混勻，6 000×g離心5 min。取150 μL上清液與3 mL OPA試劑混合并開始準(zhǔn)確計時5 min，在340 nm波長下比色。

1.2.3 保加利亞乳桿菌關(guān)鍵蛋白水解酶基因的相對表達(dá)

1.2.3.1 實時熒光定量PCR引物設(shè)計與合成

以16s rRNA作為內(nèi)參基因(管家基因)［10］，各基因引物根據(jù)GenBank提供的Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus ATCC 11842的DNA序列(GenBank accession number:NC_008054.1)中相應(yīng)基因的序列，采用primer5.0軟件設(shè)計，由上海生工生物技術(shù)有限公司合成，具體見表1。

表1 實時熒光定量PCR引物Table 1 The primer of real-time RT-PCR

1.2.3.2 提取的RNA

將活化好的菌株接種于2%滅菌脫脂乳37℃培養(yǎng)，取4、8、12和16 h發(fā)酵乳10 mL于90 mL 2%檸檬酸三鈉溶液中，充分混勻，取10 mL懸浮液離心(6 000 × g，5 min，4 ℃)，棄上清液收集菌體［11］。按照RNAprep pure培養(yǎng)細(xì)菌總RNA提取試劑盒的說明書立即抽提樣品的總RNA。

1.2.3.3 反轉(zhuǎn)錄合成cDNA

采用PrimerScript? RT反轉(zhuǎn)錄試劑盒將提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物樣本于－20℃保存?zhèn)溆谩T反應(yīng)液成分:5×PerimeScirptR Buffer 8.0 μL;PerimeScirptR RT Enzyme Mix I 2.0 μL;Oligo dT Primer(50 μmol/L)2.0 μL;Random 6 mers(100 μmol/L)2.0 μL;RNA 模板 20.0 μL，總體系為 40.0 μL。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件:37℃ 15 min，85℃ 5 s。

1.2.3.4 實時熒光定量PCR

使用 SYBR? Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒配制PCR反應(yīng)液。反應(yīng)體系:SYBR? Premix Ex TaqTMⅡ(2 ×)10.0 μL;上下游引物(10 μmol/L)各0.40 μL;ROX Reference Dye II(50 ×)0.40 μL;反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA(稀釋 10 倍)2.0 μL，ddH2O(滅菌雙蒸水)6.80 μL，總體系為 20.0 μL。使用 ABI 7500 Real-Time PCR System進(jìn)行實時熒光定量PCR實驗。本實驗采用兩步法PCR擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)程序:預(yù)變性:95℃ 30 s;PCR 反應(yīng):95℃ 5 s，60℃ 34 s，循環(huán)(40次)。不同反應(yīng)體系樣品做3次重復(fù)。

1.2.4 統(tǒng)計分析

將每個待測樣品均設(shè)3次重復(fù)，分析各基因的CT值，利用2－△△CT法對目的基因的表達(dá)量進(jìn)行評估［12］。采用SPSS16.0軟件進(jìn)行方差分析，多重比較采用Duncan方法，P＜0.05為顯著差異，P＜0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 保加利亞乳桿菌的生長曲線

為了了解菌體在脫脂乳中的生長狀況，本實驗測定了6株保加利亞乳桿菌的生長曲線(圖1)。在相同培養(yǎng)條件下，所有菌株均在培養(yǎng)4 h時進(jìn)入對數(shù)期，其中KLDS1.0501、1.9201和1.0208在12 h時進(jìn)入穩(wěn)定期，KLDS 1.0207和1.1007在培養(yǎng)10 h進(jìn)入穩(wěn)定期，而KLDS 1.9203進(jìn)入穩(wěn)定期的時間為14 h。其中，KLDS 1.9201菌株的活力最強(qiáng)，KLDS 1.0207和1.1007的活性較弱。

圖1 保加利亞乳桿菌生長曲線Fig.1 The growth curve of Lacbobacillus bulgaricus

2.2 保加利亞乳桿菌的pH值變化曲線

6株保加利亞乳桿菌的pH變化曲線見圖2。由圖可見，發(fā)酵初期，pH值下降速度緩慢，菌體進(jìn)入對數(shù)期后，迅速產(chǎn)酸，pH值快速下降。KLDS 1.9201的pH下降最快，產(chǎn)酸能力也最強(qiáng)，而KLDS 1.0207和1.1007的pH下降緩慢，產(chǎn)酸能力較弱。

2.3 保加利亞乳桿菌的蛋白水解曲線

硫醇條件下，OPA可與游離氨基酸的氨基末端反應(yīng)生成一種熒光化合物，在波長340 nm產(chǎn)生強(qiáng)吸收。依據(jù)乳蛋白被水解的程度測定乳酸菌的蛋白水解活力，OPA指數(shù)越大表示乳酸菌的蛋白水解能力越強(qiáng)。由圖3可以看出，隨著培養(yǎng)時間的延長，6株保加利亞乳桿菌的蛋白水解活力極顯著增強(qiáng)(P＜0.01)，且水解曲線的線性基本一致，菌株 KLDS 08014的蛋白水解活力最強(qiáng)。6株菌在12%脫脂乳中培養(yǎng)12 h時，以L-亮氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線計算相當(dāng)于亮氨酸的游離氨基酸的濃度，菌株KLDS 1.9201、1.0208、1.0501、1.9203、1.1007 和 1.0207 分別為 384.33 ±0.001 2、255.50 ±0.000 0、181.50 ±0.002 0、164.15 ±0.002 0、155.83±0.001 2和92.17±0.001 5 mg/L。

圖2 保加利亞乳桿菌的pH值變化Fig.2 The pH dynamic of Lacbobacillus bulgaricus

圖3 保加利亞乳桿菌的蛋白水解活力變化Fig.3 The proteolytic activity dynamic curve of Lacbobacillus bulgaricus

2.4 不同生長階段保加利亞乳桿菌關(guān)鍵蛋白水解酶基因相對表達(dá)量的動態(tài)變化

2.4.1 實時熒光定量PCR的結(jié)果

實時熒光定量PCR所得的內(nèi)參基因(16srRNA)和目的基因(prtB、oppD、pepC、pepF、pepQ、pepX、pepT)的熔解曲線如圖4所示。熔解曲線中呈現(xiàn)單一峰，排除了形成引物二聚體和非特異產(chǎn)物對試驗結(jié)果的影響，同時說明設(shè)計引物的特異性良好。

2.4.2 不同生長階段關(guān)鍵蛋白水解酶基因相對表達(dá)量的動態(tài)變化

6株保加利亞乳桿菌在發(fā)酵期間蛋白水解體系中關(guān)鍵蛋白酶基因(prtB、oppD、pepC、pepF、pepQ、pepX、pepT)的表達(dá)水平不同(圖 5)。菌株 KLDS 1.9201和1.0208的7個目的基因與對照組(4 h)相比，對數(shù)期(12 h)和穩(wěn)定期(16 h)的基因表達(dá)量均上調(diào)。6株菌的prtB和oppD基因在對數(shù)期的相對表達(dá)量高于對照組(4 h)。菌株KLDS 1.0501和1.9203內(nèi)prtB基因，在培養(yǎng)12 h時最大，且差異極顯著高于各自對照組(P＜0.01)，菌株 KLDS 1.0207、1.1007、1.9201和1.0208在對數(shù)期和穩(wěn)定期的相對表達(dá)量都有上調(diào)。菌株KLDS08007和08012內(nèi)oppD基因則在對數(shù)期上調(diào)，穩(wěn)定期下調(diào)，而菌株KLDS 1.0207、1.0501、1.9203和1.0208對數(shù)期與穩(wěn)定期均極顯著上調(diào)(P＜0.01)。6株菌的胞內(nèi)肽酶基因(pepC、pepF、pepQ、pepX、pepT)的表達(dá)量與對照組(4 h)相比，對數(shù)期均極顯著上調(diào)(P＜0.01)，除了菌株KLDS 1.0207的pepQ基因在對數(shù)期下調(diào)，但是穩(wěn)定期是上調(diào)的。隨著菌體在脫脂乳中的不斷生長，6株菌的pepC和pepF基因在對數(shù)期和穩(wěn)定期的表達(dá)量高于對照組，其中KLDS 1.0207菌株的穩(wěn)定期比對數(shù)期上調(diào)幅度大，分別為提高了6.34倍和23.57倍。菌株KLDS 1.0501的pepC基因在對數(shù)初期和穩(wěn)定期雖然相對表達(dá)量上調(diào)，但是差異不顯著(P＞0.05)。

圖4 內(nèi)參基因和目的基因PCR產(chǎn)物的熔解曲線Fig.4 The melt curves of PCR products of endogenous reference gene and target gene

圖5 不同生長階段關(guān)鍵蛋白水解酶基因的相對表達(dá)量Fig.5 Kinesis of the key protease genes expression during the different growth phase

3 討論

1974年 Mckay和 Baldwin［13］首次證明乳酸菌降解乳中酪蛋白的實質(zhì)是乳酸菌自身特有的高效蛋白水解系，他們發(fā)現(xiàn)乳酸乳球菌蛋白酶基因質(zhì)粒的治愈菌株在乳中不能高密度生長，然而在添加水解酪蛋白的乳中，質(zhì)粒治愈菌株就會同正常菌株一樣生長。乳蛋白主要包括酪蛋白和乳清蛋白，分別占乳中總蛋白的80%和20%。酪蛋白分子含有乳酸菌在乳中高密度生長所需要的所有氨基酸，然而，實際上在乳發(fā)酵過程中，只有1% ～2%的牛乳經(jīng)過水解，其水解底物是酪蛋白，而乳清蛋白的水解受到限制［14］。

研究報道，乳酸菌的不同菌種和菌株間的蛋白水解能力差異很大，其中嗜熱乳桿菌(瑞士乳桿菌、保加利亞乳桿菌和嗜酸乳桿菌等)的蛋白水解能力最高，嗜熱鏈球菌則最低(2.4 ～14.8 mg/L)［2］。本實驗研究了6株保加利亞乳桿菌的蛋白水解活力，菌株間的蛋白水解活力有顯著差異，并發(fā)現(xiàn)菌體在脫脂乳中發(fā)酵時間越長，蛋白水解活力越強(qiáng)，與 Donkor等［15］報道的 Lactobacillus delbrueckii ssp.bulgaricus 1466在還原脫脂乳中的研究結(jié)果一致。菌體在脫脂乳中處于延遲期時，菌體利用乳中少量游離氨基酸供菌體生長，進(jìn)入對數(shù)期后，乳中的游離氨基酸不能滿足菌體生長的正常氮源需求，因此，菌體依賴自身蛋白水解體系有效的降解乳中外源蛋白質(zhì)，利用降解產(chǎn)物供菌體生長。Simova［16］研究生長期和培養(yǎng)基對乳酸菌發(fā)酵劑產(chǎn)肽酶活性的影響時得出 Lactobacillus delbrueckii ssp.bulgaricus 2－11發(fā)酵6 h的游離氨基酸濃度為143.6 μmol/L。呂加平等［2］測得保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌水解乳蛋白后游離氨基酸質(zhì)量濃度為61.0～144.6 mg/L。在本研究中，保加利亞乳桿菌在乳中培養(yǎng)12 h的蛋白水解活力最高為384.33 mg/L，最低為92.17 mg/L，因此，本實驗的保加利亞乳桿菌具有較高的蛋白水解活性。

乳酸菌為了維持自身的氮平衡，可能通過調(diào)節(jié)蛋白水解體系的酶活力來改變培養(yǎng)基質(zhì)的氮源含量。研究表明蛋白酶PrtP以及轉(zhuǎn)運系統(tǒng)Opp是乳酸菌在乳中生長必不可少的，因為它們參與乳蛋白的第一步降解和轉(zhuǎn)運吸收所產(chǎn)生的相應(yīng)肽。菌株在對數(shù)期和穩(wěn)定期基因表達(dá)量上調(diào)的原因可能是此時菌體大量繁殖，需要大量的游離氨基酸，其蛋白水解酶基因大量表達(dá)，酶作用乳蛋白，生成可利用的游離氨基酸和短肽，供菌體生長需要。其中胞內(nèi)肽酶基因的相對表達(dá)量要高于胞壁蛋白酶基因和轉(zhuǎn)運體系酶基因的相對表達(dá)量。Liu等［17］在建立乳清培養(yǎng) Lactobacillus delbrueckii subsp.Bulgaricus 2038的蛋白水解體系和氨基酸合成代謝的模型時，研究菌體在不同生長階段的基因表達(dá)情況，與本實驗結(jié)果相符。Gitton等［18］通過蛋白組學(xué)的方法發(fā)現(xiàn)Lactococcus lactis NCDO763的opp、pepC和pepF基因在缺乏游離氨基酸和肽的培養(yǎng)基上生長時表達(dá)量提高，與本研究結(jié)論一致。有研究報道，在轉(zhuǎn)錄水平探討Lactobacillus casei Zhang在豆乳生長過程中，細(xì)胞內(nèi)的5種肽酶pepCl、pepC2、pepN、pepX、pepT －2 基因顯著上調(diào)控［19］。Azcarate-Peril等［20］在11%脫脂乳中培養(yǎng)Lactobacillus acidophilus時發(fā)現(xiàn)在整個培養(yǎng)過程中，prtP和pepC基因直線上調(diào)，pepT和pepX基因培養(yǎng)4 h后直線上調(diào)，與本實驗結(jié)果一致。近年來，對乳酸菌蛋白代謝機(jī)制的進(jìn)一步研究主要集中在分子生物學(xué)調(diào)控方面［21－22］，從基因水平利用代謝調(diào)控手段提高乳酸菌的高密度生長和代謝水平獲得高水平的發(fā)酵產(chǎn)品。

4 結(jié)論

本實驗結(jié)果表明，隨著保加利亞乳桿菌在脫脂乳中的不斷生長，其蛋白水解活力極顯著增強(qiáng)，同時研究發(fā)現(xiàn)蛋白水解活力較高的菌株，其生長和產(chǎn)酸特性也較高。實時熒光定量PCR分析表明，在脫脂乳中培養(yǎng)保加利亞乳桿菌，其關(guān)鍵蛋白酶基因(prtB、oppD、pepC、pepF、pepQ、pepX、pepT)的表達(dá)量呈時間依賴性，且菌株間各蛋白酶基因表達(dá)量有較大差異。

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