HPLC熒光檢測魚肉中不確定度孔雀石綠殘留量的

曹向英，沈林輝，孫文梅，朱 駿，唐丹丹，金 立

（上海市松江區(qū)食用農(nóng)產(chǎn)品安全監(jiān)督檢測中心，上海 松江 201611）

測量不確定度是判定測量結(jié)果可信度的依據(jù)。根據(jù)現(xiàn)代計量學(xué)的觀點，測量結(jié)果可信程度是需要通過分析和評定測量不確定度來確定的。本文通過數(shù)學(xué)模型，對GB/T20361-2006高效液相色譜法熒光檢測魚肉中隱性孔雀石綠殘留量的不確定度進(jìn)行了分析評定。

1 實驗過程

1.1 儀器與試劑 Alliance 2695高效液相色譜儀-2475熒光檢測器（美國Waters公司生產(chǎn)）；AE240分析天平（梅特勒-托利多公司生產(chǎn)）；T25勻漿機（德國IKA公司生產(chǎn)）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（產(chǎn)自上海愛朗）；PRS固相萃取柱（美國Varian公司生產(chǎn)）；中性氧化鋁小柱（博納艾杰爾公司生產(chǎn)）；隱性孔雀石綠對照品由DR.公司提供，含量97%；乙腈、甲醇為色譜純，其他試劑均為分析純。

1.2 樣品制備 稱取5.0g魚肉試樣，置50mL具塞離心管中，加入10mL乙腈，10000r/min勻漿提取，加入5.0g酸性氧化鋁，振蕩，4000r/min離心10min，上清液轉(zhuǎn)移至分液漏斗，再在分液漏斗中加入2mL二甘醇和3mL硼氫化鉀溶液，振搖2min；在殘渣中繼續(xù)加入1.5 mL鹽酸羥胺溶液，2.5 mL對甲苯磺酸溶液，5.0mL乙酸銨緩沖液，10mL乙腈，振蕩2min，4000r/min離心10min，上清液移入前述分液漏斗液中，再加入20mL二氯甲烷，振蕩，靜置分層。將下層溶液轉(zhuǎn)移至雞形瓶，45℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，用2.5mL乙腈溶解備用。

將PRS柱安裝在固相萃取裝置上，上端接酸性氧化鋁小柱，用5mL乙腈活化。取所有待凈化液過柱，再用乙腈洗雞形瓶兩次，棄去酸性氧化鋁柱，吹PRS柱近干，加入3mL等體積混合的乙腈和乙酸銨洗脫，用乙腈定容至3 mL，過0.45 μm微孔濾膜，供高效液相色譜法測定。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備 精密稱取隱性孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)品10.0 mg，置于100 mL容量瓶中，用乙腈配制成100μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)貯備液。精密量取2.5mL貯備液，置于100mL容量瓶中，用乙腈稀釋至刻度，制得25 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.4 數(shù)學(xué)模型

式中：X——樣品中隱性孔雀石綠的殘留量（mg/kg）；A——樣品中相應(yīng)隱性孔雀石綠的峰面積；As——標(biāo)準(zhǔn)溶液中相應(yīng)隱性孔雀石綠的峰面積；Cs——標(biāo)準(zhǔn)溶液中相應(yīng)隱性孔雀石綠的濃度（μg/mL）；V——樣液最終定容體積（mL）；m——樣品的質(zhì)量（g）。

2 測量不確定度的來源

包括標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度的不確定度u（Cs）；樣品稱樣量的不確定度u（m）；試樣峰面積測定的不確定度u（A）；標(biāo)準(zhǔn)溶液峰面積測定的不確定度u（As）；定容體積的不確定度u（V）；試樣中添加回收率的不確定度u（R）。

3 測量不確定度的計算

3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度的不確定度u（Cs）

3.1.1 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書提供的信息，隱性孔雀石綠的純度≥97.0%，不確定度半寬a=3%，服從均勻分布不確定度為：u標(biāo)物=3%/=0.0173。

3.1.2 標(biāo)準(zhǔn)品稱量的不確定度。根據(jù)稱量使用的電子天平檢定證書，其最大允許誤差為±0.05 mg，按均勻分布考慮，則標(biāo)準(zhǔn)不確定度為u（m）=0.05mg/=0.0289mg。本次稱取的標(biāo)樣量為10.03mg，則其相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：urel（m）=0.0289mg/10.03mg=2.88×10-3。

3.1.3 配制標(biāo)準(zhǔn)儲備液的不確定度。按檢定證書給定100mL的容量瓶最大允許誤差為±0.03mL，按照矩形分布換算成標(biāo)準(zhǔn)偏差為：u＝0.03mL/=0.017mL，相對urel=0.017/100=0.00017。

充滿液體至容量瓶刻度的變動性，通過重復(fù)測定進(jìn)行統(tǒng)計，重復(fù)10次統(tǒng)計出標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.12mL，從而引起的相對不確定度：urel（n）=0.12mL/100mL=0.0012。

求出此分量的合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

3.1.4 標(biāo)準(zhǔn)工作液稀釋過程產(chǎn)生的不確定度。標(biāo)準(zhǔn)工作液是由隱性孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)儲備液稀釋得到的，其質(zhì)量濃度為25.00ng/mL。稀釋過程中使用了一系列玻璃量具，根據(jù)JJG196-2006要求，均有相應(yīng)的最大允差，按均勻分布，其相對不確定度分量如表1所示。

表1 標(biāo)準(zhǔn)液稀釋過程中量具校準(zhǔn)引起的不確定度

3.2 試樣稱樣量的不確定度u（m） 天平稱量變動性的標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.02mg；天平最大允許誤差為±0.05mg，P=95%。則u＝0.05mg/＝0.029mg。求出此分量的合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

本次稱取的樣品量為5.0g，則相對不確定度：

3.3 樣品峰面積測定的不確定度u（A） 加標(biāo)濃度為2.0ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，重復(fù)進(jìn)樣3次，測得峰面積為26868、28709、27565，平均值為 27714，極差為 1841。因測定次數(shù)較少，采用極差法n=3，C=1.64測得標(biāo)準(zhǔn)不確定度：u（A）=（28709-26868）/1.64=1122，峰面積重復(fù)測量的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

3.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液峰面積As測定的不確定度u（As） 濃度為25.0ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，重復(fù)進(jìn)樣3次，測得峰面積為 545913、543619、546249，平均值為 545260，極差為2630，因測定次數(shù)較少，采用極差法，n=3，C=1.64計算得：

3.5 定容體積的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel（V） 樣品經(jīng)萃取、凈化后用5mL刻度離心管定容至3.0mL。5mL刻度離心管的容量允差為±0.1mL，按照均勻分布考慮，則定容體積的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

3.6 試樣中添加回收率的不確定度u（R） 實驗中樣品經(jīng)過了乙腈-乙酸銨混合液提取、二氯甲烷液液萃取、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮、固相萃取凈化等處理過程，受固相萃取柱質(zhì)量、人員操作等實驗條件的影響較大，在實際中表現(xiàn)為回收率的偏差。

表3 回收率測定結(jié)果（添加濃度為25.0ng/mL，n=5）

3.7 合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度的計算

3.8 擴(kuò)展不確定度 擴(kuò)展不確定度可由合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度乘以包含因子，取置信水平95%，則k=2，試樣中隱性孔雀石綠含量測定的相對擴(kuò)展不確定度u=urel（X）×k=0.096。試樣中隱性孔雀石綠含量的最佳估計值（X）=2.0μg/kg，故其擴(kuò)展不確定度 u=2.0μg/kg×0.096=0.19μg/kg。

4 結(jié)果

用高效液相色譜熒光檢測法測定魚肉中隱性孔雀石綠的含量，結(jié)果為（2.00±0.19）μg/kg。

[1]邵秋榮，方邢有.水產(chǎn)品中孔雀石綠殘留量的不確定度評定[J].中國農(nóng)學(xué)通報，2007，23（4）：105-106.

[2]國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局.GB/T20361-2006水產(chǎn)品中孔雀石綠和結(jié)晶紫殘留量的測定[S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2006：1-7.

[3]國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局.JJF1135-2005化學(xué)分析測量不確定度評定[S].北京：中國計量出版社，2005：1-12.

[4]國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局.JJG196-2006常用玻璃量器檢定規(guī)程[S].北京：中國計量出版社，2006：6-9.