流動注射化學(xué)發(fā)光法測定黃豆苷元含量及其抗氧化活性

蔣翠文，蔡卓，岳偉超，葉丹妮，尹以婷，郭瑤琪

（廣西大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，廣西 南寧 530004）

異黃酮類化合物是一類植物多酚抗氧化劑［1］，通常存在于豆科類植物中，尤其在大豆中含有多種異黃酮［2］。其中之一是黃豆苷元（7，4′-二羥基異黃酮）。黃豆苷元具有明顯的抗心律失常、抗缺氧、抗腫瘤、防止腦缺血以及降壓等多種作用［3］，能顯著地消除高血壓、冠心病以及高血脂患者頭暈以及頸疼等癥狀［4］，是治療心血管疾病、視網(wǎng)膜疾病、腦外傷后綜合癥以及消化系統(tǒng)疾病等的良藥［5－6］。建立一種靈敏可靠的黃豆苷元測定方法對其制劑的質(zhì)量控制十分重要。目前，黃豆苷元含量的測定主要有紫外［7］、氣相色譜［7］和高效液相色譜［8］等方法?；瘜W(xué)發(fā)光法具有靈敏度高、操作簡便、測定快速等優(yōu)點，已被廣泛地應(yīng)用于藥物含量的分析測定。目前，關(guān)于化學(xué)發(fā)光分析法測定黃豆苷元含量的研究尚未見報道。

本文以曙紅Y作為化學(xué)發(fā)光試劑，建立了Fe2＋-H2O2－曙紅Y化學(xué)發(fā)光新體系，并探索了該體系應(yīng)用于黃豆苷元含量測定以及對黃豆苷元抗氧化活性進(jìn)行測評的方法，研究結(jié)果報告如下。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

主要儀器：IFFM-E流動注射化學(xué)發(fā)光分析儀（西安瑞邁電子科技公司）；UV-2102PCS型紫外分光光度計（上海尤尼科儀器公司）；KQ-2200E型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器公司）。

試劑：黃豆苷元儲備液（2.0×10－3mol／L）：精密稱取0.025 4 g黃豆苷元標(biāo)準(zhǔn)品（中國食品藥品檢定研究院），溶于5 m L NaOH（8.0×10－3mol／L）中，加去離子水并超聲振蕩10 min，然后用水定容于50 m L棕色容量瓶中，4℃冰箱保存，使用時用水逐級稀釋至所需濃度。

曙紅Y儲備液（1.0×10－3mol／L）：精密稱取0.345 9 g曙紅Y用水溶解，定容于500 m L容量瓶中，使用時用水稀釋至所需濃度。Fe2＋標(biāo)準(zhǔn)溶液（5.0×10－3mol／L）：稱取0.196 1 g六水硫酸亞鐵銨溶于20 m L硫酸中（0.1 mol／L），轉(zhuǎn)移至100 m L容量瓶中定容，使用時用水逐級稀釋至所需濃度，當(dāng)天配制。

30%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）雙氧水溶液：儲存于冰箱，使用時用水稀釋至所需濃度。

H2SO4溶液（0.1 mol／L）：準(zhǔn)確量取2.72 m L質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98%的濃硫酸，移至水中稀釋，定容至500 m L；所用試劑均為分析純，水為去離子水。

1.2 實驗方法

實驗流路如圖1所示，分析儀器由兩個蠕動泵、一個六通閥（75μL進(jìn)樣體積）及流通池組成，所有管路及部件均用Ф為0.8 mm的聚四氟乙烯管連接。光電倍增管負(fù)高壓為850 V，增益為1。實驗中所用參數(shù)均由流動注射化學(xué)發(fā)光分析軟件設(shè)定。Fe2＋和曙紅Y溶液經(jīng)由相應(yīng)管道混合后作為載液輸送至分析系統(tǒng)，H2O2和去離子水通過相應(yīng)管道混合后由六通閥注入到上述載液并一起被輸送至流通池，由光電倍增管檢測化學(xué)反應(yīng)所產(chǎn)生的發(fā)光信號，發(fā)光強度記為I0；用樣品溶液代替去離子水進(jìn)行測定，得到的發(fā)光強度記為Is，以相對發(fā)光強度ΔI（ΔI＝I0－Is）對黃豆苷元進(jìn)行定量分析；將相對發(fā)光強度的降低程度作為所測物質(zhì)清除羥自由基的量化尺度。清除率的計算公式為：S ＝ ［（I0－Is）／I0］×100%.清除率S越高，代表該物質(zhì)的抗氧化活性越強。

Fig.1 Schematic diagram of the flow-injection chemiluminescence analysis system a-H 2 SO4 and Fe2＋ solution；b-eosin Y；c-H 2 O2 solution；d-sample solution or H 2 O；P1 and P2－peristaltic pumps；V-six-way injection valve；F-flow cell；W-waste solution；PMT-photomultiplier tube；HV-negative high voltage；COM-computer圖1 系統(tǒng)的流動注射化學(xué)發(fā)光流路示意圖a－硫酸與Fe2＋溶液；b-曙紅 Y；c-H 2 O2 溶液；d-樣品溶液或 H 2 O；P1，P2－蠕動泵；V-六通閥；F-流通池；W-廢液；PMT-光電倍增管；HV-負(fù)高壓；COM-計算機

2 結(jié)果與討論

2.1 儀器參數(shù)及流路的選擇

考察了不同流路和泵速對體系的發(fā)光信號強度的影響。結(jié)果顯示：當(dāng)采用圖1的流路時，所得到發(fā)光信號最強，因而選擇圖1流路。實驗發(fā)現(xiàn)，發(fā)光強度隨著主泵泵速的增加而增強，副泵泵速則基本無影響。綜合考慮發(fā)光強度和試劑用量兩因素，本實驗選擇主、副蠕動泵的泵速分別為75 r／min和50 r／min。

2.2 反應(yīng)體系酸度的影響

分別考察了以H2SO4、HNO3、HCl作為反應(yīng)介質(zhì)時體系的化學(xué)發(fā)光情況。結(jié)果表明，在H2SO4介質(zhì)中體系的化學(xué)發(fā)光強度達(dá)到最大，因此選擇H2SO4作為本體系的反應(yīng)介質(zhì)。進(jìn)一步考察了0.004～0.07 mol／L H2SO4濃度對發(fā)光強度的影響，發(fā)現(xiàn)當(dāng)H2SO4濃度為0.035 mol／L時，體系發(fā)光強度達(dá)到最大，故選擇H2SO4濃度為0.035 mol／L。

2.3 Fe2＋濃度的影響

考察了5.0×10－5～8.0×10－4mol／L Fe2＋對體系化學(xué)發(fā)光強度的影響情況。結(jié)果表明，體系的發(fā)光強度隨Fe2＋濃度的不斷增大而增強。當(dāng)溶液中Fe2＋濃度大于4.0×10－4mol／L時體系發(fā)光強度逐步下降?？赡苁沁^多的Fe2＋與·OH發(fā)生反應(yīng)，降低了溶液中·OH的濃度，導(dǎo)致化學(xué)發(fā)光強度降低。因此，實驗選擇Fe2＋濃度為4.0×10－4mol／L。

2.4 H 2 O2濃度的影響

H2O2濃度與·OH的產(chǎn)量密不可分。實驗考察了0.006～0.06 mol／L的H2O2濃度對體系發(fā)光強度的影響。結(jié)果顯示，體系的發(fā)光強度隨著溶液中H2O2濃度的不斷增加而迅速增大，當(dāng)H2O2濃度增大到0.03 mol／L時發(fā)光強度達(dá)到最強，隨后開始下降。出現(xiàn)這種情況的原因可能是過多的H2O2與溶液中生成的·OH直接反應(yīng)，使·OH減少，導(dǎo)致發(fā)光強度降低［10］。本實驗選擇H2O2濃度為0.03 mol／L。

2.5 曙紅Y濃度的影響

考察了曙紅Y濃度在1.0×10－5～1.0×10－4mol／L范圍內(nèi)對化學(xué)發(fā)光強度的影響。結(jié)果表明，當(dāng)曙紅Y濃度低于4.0×10－5mol／L時，體系的發(fā)光強度隨著曙紅Y濃度的不斷增大而增強，當(dāng)其濃度達(dá)到4.0×10－5mol／L時，化學(xué)發(fā)光強度最高，隨后又逐漸減小。本實驗選擇曙紅Y的濃度為4.0×10－5mol／L。

綜上所述，本實驗確定的化學(xué)發(fā)光新體系為0.035 mol／L H2SO4，4.0×10－4mol／L Fe2＋，0.03 mol／L H2O2，4.0×10－5mol／L曙紅 Y。

2.6 線性范圍、檢出限及精密度

在選定的最佳實驗條件下，黃豆苷元在8.0×10－8～3.0×10－6mol／L范圍內(nèi)與相對發(fā)光強度（△I）呈良好線性關(guān)系，線性回歸方程為：△I＝1.0×108C＋58.47（R＝0.998 2）；對1.0×10－6mol／L的黃豆苷元溶液進(jìn)行平行測定11次，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.6%。根據(jù)IUPAC的建議，計算該方法的檢出限為9.0×10－9mol／L。

2.7 干擾試驗

考察了黃豆苷元片劑中可能的添加組分以及常見的離子對黃豆苷元測定的干擾情況。結(jié)果表明，在黃豆苷元濃度為1.0×10－6mol／L、發(fā)光強度相對誤差不超過±5%的條件下，800倍的檸檬酸、600倍的淀粉、500倍的NO－3、K＋、Cl－、Na＋和HCO－3、400倍的葡萄糖和乳糖、300倍的硬脂酸鎂、200倍的Mg2＋和Zn2＋、80倍的麥芽糖對測定無干擾。

2.8 樣品分析

準(zhǔn)確稱取10片黃豆苷元片（遼寧一成藥業(yè)有限公司），研細(xì)混勻，精確稱量相當(dāng)于一片藥劑質(zhì)量的粉末，加入蒸餾水溶解并超聲振蕩10 min，加水定容至50 m L容量瓶中，然后用干濾紙過濾。取適量的濾液加水稀釋至工作曲線范圍內(nèi)，按照實驗方法進(jìn)行測定，同時做回收實驗，并參照藥典［12］以UV-vis方法進(jìn)行對照實驗，結(jié)果列于表1。經(jīng)過t檢驗，本法與藥典方法在95%置信水平上無顯著性差異。

表1 黃豆苷元片劑的測定結(jié)果（n＝5）Table 1 Measurement results of daidzein in tablets（n ＝ 5）

2.9 抗氧化活性測評

黃豆苷元屬于異黃酮類化合物，對人體內(nèi)產(chǎn)生的氧自由基有一定的清除作用，同時也是其發(fā)揮藥效的原因之一。我們選用DMSO與甘露醇作為參照物，采用Fenton試劑模擬產(chǎn)生羥自由基（·OH），以曙紅Y為發(fā)光試劑對黃豆苷元清除羥自由基的能力進(jìn)行測評。按照實驗方法，對1.0×10－5～1.0×10－3mol·L－1濃度范圍內(nèi)的DMSO、甘露醇以及黃豆苷元溶液進(jìn)行測定，分別算出不同溶液所對應(yīng)的清除率S，通過Origin7.5對清除率－物質(zhì)濃度曲線圖進(jìn)行非線性擬合（圖2），可得到清除率為50%所需物質(zhì)的濃度IC50。用IC50來比較抗氧化活性的大小，IC50越小，抗氧化活性越大。由圖2得出黃豆苷元、二甲亞砜、甘露醇的IC50值分別為6.13×10－5，1.08×10－4，5.31×10－4mol／L。因此三種化合物對羥自由基的清除能力的高低次序分別為：黃豆苷元＞二甲亞砜＞甘露醇，說明黃豆苷元具有較強的抗氧化能力。

Fig.2 Scavenging rate of daidzein，mannitol and dimethyl sulphoxide圖2 黃豆苷元、二甲亞砜、和甘露醇濃度與清除率的關(guān)系

3 小結(jié)

本文將曙紅Y作為化學(xué)發(fā)光試劑，建立了Fe2＋-H2O2－曙紅Y化學(xué)發(fā)光新體系，并根據(jù)該體系的特點結(jié)合流動注射技術(shù)將其應(yīng)用于黃豆苷元的含量測定；又依據(jù)黃豆苷元對·OH的清除作用，對其抗氧化活性的進(jìn)行了測評。與藥典中的紫外法相比，本法具有簡單、快速、靈敏度更高的特點，同時還可以用于抗氧化性藥物的篩選。

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