直接皂化法制備葉綠素銅鈉鹽

韓敏

(西安文理學(xué)院化學(xué)與化學(xué)工程學(xué)院，陜西西安 710065)

葉綠素屬于卟啉類化合物［1］，是重要的天然色素，廣泛存在于植物和某些動物體內(nèi)，常作為著色劑或添加劑應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、日用化工等領(lǐng)域［2-4］。我國養(yǎng)蠶歷史悠久，是世界蠶業(yè)的發(fā)源地和主產(chǎn)國［5-6］，而且研究表明，蠶沙中葉綠素的質(zhì)量分數(shù)約為0.8% ～1.0%，高于綠色植物中的含量［7］。但由于葉綠素的穩(wěn)定性差，故將葉綠素合成其衍生物，如葉綠素鐵鈉鹽［8］、葉綠素鋅鈉鹽［9］、葉綠素銅鈉鹽［10］等。

葉綠素銅鈉鹽是一種略帶胺味的墨綠色結(jié)晶性粉末，具有光亮的色澤、無毒、穩(wěn)定性良好的特點，且營養(yǎng)價值高，在食品和日用化工中有很廣泛的運用。

傳統(tǒng)葉綠素銅鈉鹽的制備是先用有機溶劑提取葉綠素然后濃縮再皂化［11］，工藝路線較長，成本高。本研究將葉綠素的提取與皂化合并，研究了直接皂化法制備葉綠素銅鈉鹽的最佳工藝條件，并與傳統(tǒng)的工藝作了比較。

1 實驗部分

1.1 材料與儀器

蠶沙，陜西安康旬陽;95%乙醇、氫氧化鈉、石油醚、硫酸、硫酸亞銅、無水乙醇均為分析純。

KQ5200DE型數(shù)控超聲波清洗器;7230G型可見分光光度計;R201L型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀;IS50型傅里葉紅外光譜儀。

1.2 實驗方法

1.2.1 原料預(yù)處理 將市售的蠶沙于40～50℃烘干后，用粉碎機粉碎后備用。

1.2.2 葉綠素直接提取皂化、濃縮 稱取干蠶沙粉10 g，于250 mL燒杯中，加入15 mL蒸餾水，軟化20 min。加入95%乙醇100 mL，并用10%NaOH調(diào)節(jié)體系pH值為12，放在超聲波清洗器中，在70℃超聲處理2 h。冷卻至室溫，取樣分析。提取皂化反應(yīng)后，把溶液減壓濃縮，回收溶劑乙醇。

1.2.3 萃取除雜 將濃縮后的溶液倒入分液漏斗中，加入1∶1的石油醚，進行萃取除雜，然后將墨綠色的皂化液轉(zhuǎn)入三口燒瓶中，棄去上層雜質(zhì)。多萃取幾次，回收萃取劑石油醚。

1.2.4 酸化置銅 將萃取液用6 mol/L H2SO4調(diào)節(jié) pH2～3，60 ℃酸化30 min，加入10%CuSO4溶液6 mL反應(yīng)120 min，使葉綠素銅酸顆粒充分析出。過濾，依次用30℃蒸餾水和30%乙醇溶液洗滌，直至濾液呈中性為止。濾餅在60℃烘干得到純凈的葉綠素銅酸。

1.2.5 成鹽 用丙酮將純凈的葉綠素銅酸溶解，用10%NaOH-CH3CH2OH調(diào)節(jié)溶液pH≈12使葉綠素銅酸成鹽析出，在60℃下烘干，得到具有光亮的色澤、無毒、穩(wěn)定性良好的葉綠素銅鈉鹽。

1.3 葉綠素含量的測定

吸取0.45 mL用石油醚萃取后的溶液于10 mL容量瓶中，加入95%乙醇至刻度線，在649 nm和665 nm處測定其吸光度值。計算公式如下［11］:

葉綠素 a濃度 Ca=13.97A665－6.89A649

葉綠素 b 濃度 Cb=24.95A649－7.30A665

葉綠素總濃度C總=Ca+Cb

葉綠素提取率=C總×V溶液×稀釋倍數(shù)/M樣品

2 結(jié)果與討論

2.1 體系pH對葉綠素含量的影響

反應(yīng)條件同1.2節(jié)，結(jié)果見圖1。

圖1 體系pH對葉綠素含量的影響Fig.1 The influence of the system of pH on the chlorophyll content

由圖1可知，當(dāng)pH≈12時，葉綠素的含量趨于穩(wěn)定，繼續(xù)增加堿的用量，葉綠素含量不再降低。所以，應(yīng)將體系pH值維持在12左右。

2.2 超聲時間對葉綠素含量的影響

反應(yīng)條件同1.2節(jié)，結(jié)果見圖2。

由圖2可知，隨著時間的延長，葉綠素含量降低較快，≥120 min時，葉綠素含量降低趨于平緩。原因可能是:①皂化反應(yīng)本身就是一個可逆反應(yīng)，在某一時間會達到平衡狀態(tài);②葉綠素在溫度比較高的條件下會分解，在120～180 min，葉綠素的緩慢降低是由于葉綠素被氧化分解變性了。所以，超聲時間應(yīng)控制在120 min。

圖2 超聲時間對葉綠素含量的影響Fig.2 The influence of ultrasonic time on the chlorophyll content

2.3 超聲溫度對葉綠素含量的影響

反應(yīng)條件同1.2節(jié)，結(jié)果見圖3。

圖3 超聲溫度對葉綠素含量的影響Fig.3 The influence of ultrasonic temperature on the chlorophyll content

由圖3可知，超聲溫度在70℃以上時，皂化液中的葉綠素降低趨于平緩。原因可能是:溫度升高，動態(tài)反應(yīng)平衡向右移動，而70℃時反應(yīng)達到動態(tài)平衡，此時繼續(xù)增加溫度，產(chǎn)品得率增加平緩，而且還會使葉綠素降解。因此，超聲溫度以70℃為宜。

2.4 加銅量對產(chǎn)品產(chǎn)量的影響

反應(yīng)條件同1.2節(jié)，結(jié)果見圖4。

圖4 加銅量對產(chǎn)品產(chǎn)量的影響Fig.4 The influence of dosage of copper on the product production

由圖4可知，隨著10%CuSO4溶液量的增加，葉綠素銅鈉鹽的產(chǎn)量也在增加，當(dāng)10%CuSO4增加到6 mL時，葉綠素銅鈉鹽的產(chǎn)量增長幅度變得的很小，如果繼續(xù)加入10%CuSO4溶液，不僅增加成本，而且還對后期污水的處理增加工作量。所以，加入10%CuSO4溶液為6 mL。

2.5 置銅時間對產(chǎn)品產(chǎn)量的影響

反應(yīng)條件同1.2節(jié)，結(jié)果見圖5。

圖5 置銅時間對產(chǎn)品產(chǎn)量的影響Fig.5 The influence of time on the product production

由圖5可知，延長反應(yīng)時間可以有效地增加產(chǎn)品的產(chǎn)量，但120 min后，產(chǎn)量快速降低。因此，選擇置銅時間為120 min。

2.6 置銅溫度對產(chǎn)品產(chǎn)量的影響

反應(yīng)條件同1.2節(jié)，結(jié)果見圖6。

圖6 置銅溫度對產(chǎn)品產(chǎn)量的影響Fig.6 The influence of temperature on the product production

由圖6可知，升高溫度，可以有效地增加產(chǎn)品的產(chǎn)量，但65℃以上時繼續(xù)升高溫度，葉綠素銅鈉鹽的產(chǎn)量反而降低。原因可能是:①隨著溫度的升高溶劑的揮發(fā)，會使生成的葉綠素銅酸的濃度也增大，該置銅反應(yīng)是一個可逆反應(yīng)，產(chǎn)物濃度增大會使反應(yīng)逆向進行，從而使已經(jīng)生成的葉綠素銅酸又被分解;②葉綠素銅酸的溶解度隨著溫度的升高而增大，溫度過高不能使葉綠素銅酸完全析出來，而是溶解在溶液里。所以，綜合考慮選取65℃為酸化置銅最優(yōu)溫度。

2.7 正交實驗結(jié)果

選取pH值、超聲溫度、置銅時間和加銅量，采用4因素3水平進行。正交實驗因素和水平見表1，結(jié)果見表2

表1 因素水平Table 1 Factors and levels

表2 正交實驗結(jié)果Table 2 Results of the orthogonal test

由表2可知，影響葉綠素銅鈉鹽制備諸因素的主次關(guān)系為:體系pH＞置銅時間＞置銅量＞超聲溫度。制備葉綠素銅鈉鹽的最優(yōu)條件為A2B3C3D2，加堿使皂化體系pH≈12，置銅時間為150 min，置銅量為6 mL，超聲溫度為80℃。

2.8 對照實驗結(jié)果

2.8.1 傳統(tǒng)制備法 稱取干蠶沙粉10 g于250 mL燒杯中，加入15 mL蒸餾水軟化20 min。加入95%乙醇100 mL，放置在超聲波清洗器中，在70℃下超聲時間120 min。將提取液轉(zhuǎn)入250 mL三口燒瓶中，用10%NaOH調(diào)節(jié)pH≈12，水浴溫度為70℃，皂化120 min。用 6 mol/L H2SO4調(diào)節(jié) pH 2～3，65℃下酸化30 min，加入6 mL 10%CuSO4溶液，置銅時間150 min。最后用10%NaOH-CH3CH2OH調(diào)節(jié)溶液，使葉綠素銅酸成鹽析出。

2.8.2 直接皂化法 稱取干蠶沙粉10 g于250 mL燒杯中，加入15 mL蒸餾水軟化20 min。加入95%乙醇100 mL，并用10%NaOH調(diào)節(jié)pH≈12，放置在超聲波清洗器中，在70℃下超聲時間120 min。用等量石油醚萃取3次，萃取液轉(zhuǎn)入250 mL三口燒瓶中，用6 mol/L H2SO4調(diào)節(jié) pH 2～3，65℃下酸化30 min。加入 6 mL 10%CuSO4溶液，置銅時間150 min。用10%NaOH-CH3CH2OH調(diào)節(jié)溶液，使葉綠素銅酸成鹽析出，實驗結(jié)果見表3。

表3 對照實驗結(jié)果Table 3 Results of the comparison experiment

由表3可知，直接皂化法葉綠素銅鈉鹽的得率大于傳統(tǒng)制備法葉綠素銅鈉鹽的得率，而且比傳統(tǒng)制備法少一道工序，因此直接皂化法是可行的。

2.9 產(chǎn)品分析

2.9.1 產(chǎn)品性狀 制備的葉綠素銅鈉鹽是一種略帶胺味的墨綠色結(jié)晶性粉末，具有光亮的色澤、無毒、穩(wěn)定性良好的特點，極易溶于水，呈透明鮮綠色;微溶于CH3CH2OH和氯仿，幾乎不溶于石油醚和無水乙醚。

2.9.2 紫外-可見光譜(UV-Vis)分析 見圖7。

圖7 葉綠素銅鈉鹽的UV-Vis譜圖Fig.7 UV-Vis spectrum of the copper sodium chlorophyll

由圖7可知，產(chǎn)品的最大吸收波長為413 nm和628 nm，與從竹葉中提取的葉綠素銅鈉鹽［12］的最大吸收波長基本上一致。

2.9.3 紅外光譜(FTIR)分析 見圖8。

圖8 葉綠素銅鈉鹽的FTIR譜圖Fig.8 FTIR spectrum of the copper sodium chlorophyll

3 結(jié)論

以蠶沙為原料，采用直接皂化法制備葉綠素銅鈉鹽的最優(yōu)工藝參數(shù)為:10 g干蠶沙粉先在pH 12的體系中，80℃下超聲120 min;再于pH 2～3的體系中，65℃下酸化30 min，加入6 mL 10%CuSO4溶液，置銅150 min，最后用10%NaOH-CH3CH2OH調(diào)節(jié)溶液使葉綠素銅酸成鹽析出。在此條件下，葉綠素銅鈉鹽的產(chǎn)率為2.12%，比傳統(tǒng)制備法要高。

［1］羅慶鋒.葉綠素的研究進展及葉綠素銅鈉鹽的開發(fā)利用［J］.林產(chǎn)化工通訊，1995(1):32-33.

［2］王順民，牛彬.萵筍葉葉綠素的提取工藝研究［J］.安徽工程科技學(xué)院學(xué)報，2007，22(4):14-17.

［3］李景琳，李傳欣，張華.葉綠素銅鈉鹽生產(chǎn)工藝與產(chǎn)品質(zhì)量關(guān)系［J］.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，1998，29(2):196-198.

［4］汪坤，洪海，金文英，等.微波輔助提取蠶沙中葉綠素的工藝研究［J］.食品科學(xué)，2009，30(6):76-79.

［5］Xu X Q.Research on pigment extracted from the byproduct of silkworm and applied to dye silk fabrics［D］.Soochow:Soochow University，2007.

［6］Sun B，Li Y，Wu H L，et al.Progress in study of extracting process of silkworm excrement［J］.Plant Physiol，2009，31(4):18-21.

［7］胡軍華，張袁松，李鴻筠，等.蠶糞中提取葉綠素銅鈉鹽的穩(wěn)定性研究［J］.蠶業(yè)科學(xué)，2005，31(3):370-373.

［8］王立娟，錢學(xué)仁.竹葉葉綠素鐵鈉的制備及性質(zhì)研究［J］.林產(chǎn)化學(xué)與工業(yè)，2006，25(3):89-92.

［9］才紅，鄭炳燦.葉綠素鋅鈉制備的研究［J］.食品研究與開發(fā)，2006，27(5):19-21.

［10］楊國恩，陳叢瑾.毛竹葉葉綠素銅鈉的制備［J］.生產(chǎn)應(yīng)用，2009，25(20):127-129.

［11］李祥，種亞莉，曹江絨，等.微波協(xié)同超聲輔助提取蠶沙葉綠素的工藝研究［J］.日用化學(xué)工業(yè)，2013，43(4):285-289.

［12］童曉濱，謝好.竹葉葉綠素銅鈉的制備及其光譜研究［J］.化學(xué)工程師，2009，22(5):21-24.