心臟組織特異性表達(dá)Neuregulin-2轉(zhuǎn)基因小鼠的建立及心臟功能分析

路迎冬，鮑 丹，劉 寧，張 旭，馬元武，呂 丹，張連峰

（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心，衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100021）

心臟組織特異性表達(dá)Neuregulin-2轉(zhuǎn)基因小鼠的建立及心臟功能分析

路迎冬，鮑 丹，劉 寧，張 旭，馬元武，呂 丹，張連峰

（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心，衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100021）

目的 神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白2（neuregulin-2，NRG2）可促進(jìn)神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育，基因缺失表現(xiàn)早期生長(zhǎng)延遲，NRG2在心臟中也有表達(dá)，但其在心臟發(fā)育尤其是病理刺激時(shí)對(duì)心臟結(jié)構(gòu)及功能的影響尚未見報(bào)道。本文目的是建立心臟組織特異性表達(dá)NRG2轉(zhuǎn)基因小鼠，分析其在正常及壓力負(fù)荷刺激時(shí)對(duì)心臟結(jié)構(gòu)及功能的影響。方法將人NRG2基因插入到心臟特異性啟動(dòng)子α-MHC下游，構(gòu)建轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體，顯微注射法建立NRG2轉(zhuǎn)基因小鼠，PCR鑒定轉(zhuǎn)基因小鼠基因型，western blot鑒定NRG2蛋白在心臟中的表達(dá)并篩選高表達(dá)的轉(zhuǎn)基因品系，主動(dòng)脈縮窄術(shù)（transverse aortic constriction，TAC）制備壓力負(fù)荷誘導(dǎo)的心肌肥厚小鼠模型。利用超聲影像分析和病理學(xué)觀察小鼠心臟結(jié)構(gòu)和功能改變。結(jié)果 建立了心臟組織特異性高表達(dá)NRG2轉(zhuǎn)基因小鼠品系。與同窩陰性轉(zhuǎn)基因小鼠相比，轉(zhuǎn)基因小鼠左心室舒張末期后壁厚度（LVPWD）明顯增加，3月齡時(shí)可達(dá)15.6％（P＜0.05），經(jīng)壓力負(fù)荷刺激后，NRG2轉(zhuǎn)基因手術(shù)小鼠心室壁增厚程度顯著下降，心室腔增大，同時(shí)心肌排列紊亂程度和纖維化程度明顯比NTG手術(shù)小鼠嚴(yán)重。結(jié)論 在壓力負(fù)荷下，轉(zhuǎn)基因表達(dá)NRG2縮短了肥厚過程，同時(shí)加速了心衰進(jìn)程。

NRG2；轉(zhuǎn)基因；壓力負(fù)荷；心室重構(gòu)

神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白（neuregulins，NRGs）是神經(jīng)系統(tǒng)及心臟等器官介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞間相互作用的信號(hào)蛋白，屬于表皮生長(zhǎng)因子家族成員，參與細(xì)胞增殖，分化及細(xì)胞形態(tài)的形成［1］，NRGs通常包括6個(gè)識(shí)別結(jié)構(gòu)域，分別是N末端結(jié)構(gòu)域，免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域，糖基化富集間隔區(qū)，表皮生長(zhǎng)因子（epidermal growth factor，EGF）樣結(jié)構(gòu)域，疏水跨膜結(jié)構(gòu)域和羧基末端尾巴［2］。NRGs通過與酪氨酸激酶受體家族的EGF受體結(jié)合介導(dǎo)相應(yīng)的生物學(xué)功能，包括ErbB1，ErbB2，ErbB3，ErbB4受體間通過形成同源或異源二聚體，使胞內(nèi)酪氨酸激酶磷酸化，募集胞內(nèi)各種磷酸酶發(fā)揮生物學(xué)作用［3，4］。目前，已知NRGs包括4個(gè)成員，分別是NRG1，NRG2，NRG3及NRG4。其中NRG1是4個(gè)成員中結(jié)構(gòu)和功能研究的較為徹底的一個(gè)，NRG1主要表達(dá)于心內(nèi)膜及心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞，與心肌細(xì)胞上的ErbB受體相互作用，在心肌細(xì)胞的發(fā)育、存活及維持成熟心肌細(xì)胞的功能方面發(fā)揮重要的作用［5］。NRG4的體外試驗(yàn)中證實(shí)在胰腺中能夠促進(jìn)分泌生長(zhǎng)激素抑制素細(xì)胞的分化，而NRG3的功能目前還不清楚［5，6］。

NRG2又稱 NTAK（neural- and thymusderived activator for the ErbB kinase），Don-1 （divergent of neuregulin 1）或HRG2（heregulin2），與NRG1的同源性最高，能夠直接激活 ErbB3和ErbB4，間接激活ErbB2［7］，而ErbB2和ErbB4對(duì)于維持心臟的功能具有重要作用［10］，提示NRG2可能參與心臟組織發(fā)育。然而目前尚無關(guān)于NRG2在心臟發(fā)育及相關(guān)心臟疾病調(diào)控的研究報(bào)道，在本室前期研究中發(fā)現(xiàn)NRG2在心臟中表達(dá)，并且心肌病發(fā)生時(shí)，其表達(dá)會(huì)發(fā)生改變，提示其可能參與的心肌病發(fā)生發(fā)展。所以本研究特建立心臟組織特異性表達(dá)NRG2轉(zhuǎn)基因小鼠，分析其在正常及壓力負(fù)荷刺激下對(duì)心臟結(jié)構(gòu)形態(tài)及功能的影響，以期為NRG2參與心臟發(fā)育及心臟疾病的調(diào)節(jié)作用的分析提供模型動(dòng)物及理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 NRG2轉(zhuǎn)基因載體構(gòu)建及轉(zhuǎn)基因小鼠模型的建立

以pCMV6-XL5-h-NRG2質(zhì)粒（OriGene，美國，Clone ID NM_013983）為模板，用 PCR法擴(kuò)增人NRG2 全 長(zhǎng) cDNA，上 游 引 物 為：5’-CCCAAGCTTATGGCCTGGCCAGATGCG，下游引物為：5’-CCGCTCGAGTCCTTAAAGATAGTGGGGCGG GC（上海英俊生物技術(shù)有限公司合成，中國）。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s，64℃退火30 s，72℃延伸3 min，30個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增片段大小為2559 bp。將擴(kuò)增片段插入PMD18T載體，經(jīng)測(cè)序比對(duì)正確后，以Hind III和Xho I（寶生物工程有限公司，中國）酶切回收NRG2片段，并插入到α-MHC啟動(dòng)子的下游構(gòu)建心臟特異性表達(dá)的NRG2表達(dá)載體，再用Pvu I（寶生物工程有限公司，中國）將其線性化，Sephedex G50柱純化 DNA片段，獲得表達(dá)NRG2基因的轉(zhuǎn)基因片段，注射前將轉(zhuǎn)基因片段濃度調(diào)至5 ng/μL，用顯微注射法將線性化的轉(zhuǎn)基因載體注射到C57BC/6J小鼠的受精卵中（小鼠購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司【SCXK（京）2012-001】），使用ICR小鼠作為假孕受體小鼠 （購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司【SCXK（京）2012-001】），制備轉(zhuǎn)基因小鼠（TE2000U纖維注射儀）。實(shí)驗(yàn)在本研究所衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成【SCXK（京）2013-002】，實(shí)驗(yàn)中涉及動(dòng)物操作程序已經(jīng)得到中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所動(dòng)物使用與管理委員會(huì)批準(zhǔn)，批準(zhǔn)號(hào)為ILAS-GC-2012-001。

1.2 PCR鑒定NRG2轉(zhuǎn)基因小鼠基因型

轉(zhuǎn)基因小鼠在出生7-14 d時(shí)，用剪腳趾標(biāo)記法標(biāo)記，收集剪下的組織，堿裂解法提取基因組DNA［11］，PCR法對(duì)首建鼠進(jìn)行篩選。PCR上游引物為：NRG2-S30 5’-ATGCTGCTCTTCGGTGTGT，下游引物為：NRG2-A739 5’-CCGTCTGGCTCTTC ATCTTC。PCR反應(yīng)體系20μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。擴(kuò)增片段大小為433 bp。

1.3 western blot鑒定NRG2蛋白的表達(dá)

頸椎脫臼法犧牲小鼠，提取F1代轉(zhuǎn)基因陽性和轉(zhuǎn)基因陰性（non-transgenic，NTG）小鼠心臟組織總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度，取20μg蛋白經(jīng)高溫變性后，進(jìn)行8％的SDS-PAGE凝膠電泳，將蛋白轉(zhuǎn)移至NC膜上（Millipore，美國），用含有5％脫脂奶粉的TBST（20 mmol/L Tris，0.05％Tween，pH 7.6）封閉NC膜，用NRG2單克隆抗體（1：1000稀釋，WH0009542M，sigma，美國）檢測(cè)NRG2蛋白表達(dá)水平，采用HRP-偶聯(lián)的羊抗鼠抗體（1∶10000稀釋，ZB-2305，康成生物，中國）結(jié)合一抗。選用HRP-偶聯(lián)的β-actin單克隆抗體（1：10000稀釋，KC-5A08，中杉金橋，中國）作為內(nèi)參。用Image J分析軟件分析western blot條帶灰度。

1.4 超聲影像分析

小鼠經(jīng)腹腔注射三溴乙醇（18 mL/kg體重）麻醉，脫胸前區(qū)被毛，仰臥固定于加熱板上，以保持體溫，四肢固定，選用30Hz的探頭，按住Zhou YQ［12］報(bào)道的方法進(jìn)行心臟超聲影像分析（Vevo770小動(dòng)物超聲影像系統(tǒng)，加拿大）。

1.5 壓力負(fù)荷誘導(dǎo)的心肌肥厚小鼠模型建立

采 用 主 動(dòng) 脈 縮 窄 手 術(shù) （thoracic aorta constriction，TAC）建立壓力負(fù)荷誘導(dǎo)的心肌肥厚小鼠模型。小鼠經(jīng)腹腔注射三溴乙醇麻醉、脫毛、仰臥位固定。氣管插管連至呼吸機(jī)（頻率為125～150次/min）進(jìn)行部分開胸手術(shù)。利用27G平頭針頭于無名動(dòng)脈［innominate artery（IA），即頭臂動(dòng)脈干（brachiocephalic trunk）］ 和左頸總動(dòng)脈 （left common carotid artery，LCCA）間動(dòng)脈弓進(jìn)行結(jié)扎，獲得理論直徑為 0.4 mm重建血管。假手術(shù)（Sham）小鼠動(dòng)脈重建步驟外，其余步驟與TAC手術(shù)小鼠相同［13］。

1.6 病理觀察

頸椎脫臼犧牲小鼠，打開胸腔取出心臟，將心臟組織固定在中性福爾馬林中24h。脫水，石蠟包埋及切片，HE和 Masson［13］染色后顯微鏡下觀察（Nikon顯微鏡，日本）組織學(xué)變化。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以Mean±SD表示，用Student’s ttests或one-way ANOVA分析處理數(shù)據(jù)，P＜0.05為有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 NRG2轉(zhuǎn)基因小鼠的建立

用PCR法克隆的NRG2基因，測(cè)序結(jié)果表明克隆片段同已報(bào)道的NRG2序列完全一致（Gene ID：9542）。將人的NRG2基因插入到心臟特異表達(dá)的α-MHC啟動(dòng)子下游，構(gòu)建得到人NRG2轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體（圖1A）。用顯微注射法將線性化的轉(zhuǎn)基因載體注射到C57BL/6J小鼠的受精卵中，轉(zhuǎn)入到ICR假孕受體小鼠中，出生的首建鼠與野生型小鼠交配獲得子代轉(zhuǎn)基因小鼠。提取小鼠基因組DNA，用PCR法擴(kuò)增NRG2目的基因片段，大小為433 bp，鑒定小鼠基因型（如圖1B）。提取心臟組織總蛋白，用NRG2單克隆抗體進(jìn)行western blot分析，Image J軟件分析條帶灰度，對(duì)western blot結(jié)果進(jìn)行定量，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因小鼠心臟組織NRG2的表達(dá)顯著高于同齡陰性對(duì)照小鼠（NTG）（P＜0.05）（圖1C和1D），同時(shí)NRG2轉(zhuǎn)基因小鼠可穩(wěn)定傳代。

圖1 α-MHC-NRG2轉(zhuǎn)基因小鼠模型的建立Note：M：DNA molecular weightmarker DL2000；A，The construct of α-MHC-NRG2 expression vector.B，PCR to identify the genotype of NRG2 transgenic mouse.C，Western Blot to analysis the NRG2 expression level in heart tissue of transgenic mice，β-actin as internal reference.D，The quantitative analysis of the NRG2 protein level in heart tissue.Fig.1 The establishment ofα-MHC-NRG2 transgenicmice

2.2 NRG2轉(zhuǎn)基因小鼠心臟結(jié)構(gòu)和功能分析

NRG2轉(zhuǎn)基因小鼠于1、3和5月齡進(jìn)行心臟超聲影像分析（圖2），與NTG小鼠相比，左心室舒張末期內(nèi)徑 （left ventricular internal dimension at endiastole，LVIDD）在三個(gè)時(shí)間點(diǎn)變化均不明顯；左心室舒張末期后壁厚度（left ventricular posterior wall at endiastole，LVPWD）明顯增加，3月齡時(shí)可達(dá)15.6％（P＜0.05），舒張期左心室容積變化也不明顯（LV end-diastolic volume，LVEDV）有微弱的增加趨勢(shì)。

圖2 α-MHC-NRG2轉(zhuǎn)基因小鼠1、3和5月齡心臟超聲表型分析Note：M：month；“▲”：NTG；“■”：NRG2.Fig.2 The echocardiography analysis ofα-MHC-NRG2 transgenic mice at1，3 and 5 months of age

2.3 壓力負(fù)荷情況下NRG2轉(zhuǎn)基因小鼠心臟結(jié)構(gòu)和功能分析

對(duì)2月齡NRG2轉(zhuǎn)基因和同窩陰性小鼠進(jìn)行TAC手術(shù)處理，于術(shù)后4周對(duì)小鼠進(jìn)行心臟超聲影像分析（圖3）。與假手術(shù)組（Sham）小鼠相比，NTG小鼠經(jīng)過TAC手術(shù)處理后的LVIDD變化不明顯。NTG小鼠經(jīng)過TAC手術(shù)處理后的LVEDV有微弱的下降，而轉(zhuǎn)基因小鼠經(jīng)過 TAC手術(shù)處理后的LVEDV增加22.8％。NTG小鼠經(jīng)過TAC手術(shù)處理后的LVPWD增加明顯，高達(dá)37.0％，而NRG2轉(zhuǎn)基因小鼠LVPWD僅增加4.1％。說明轉(zhuǎn)基因表達(dá)NRG2后，心臟在壓力負(fù)荷下的肥厚過程被抑制，而是表現(xiàn)為左心室擴(kuò)大的病理表型。

圖3 α-MHC-NRG2轉(zhuǎn)基因小鼠TAC術(shù)后超聲分析心臟表型和功能變化Note：“■”：Sham；“□”：TAC.Fig.3 Morphology and function changes after TAC treatment byechocardiography analysis

2.4 壓力負(fù)荷情況下NRG2轉(zhuǎn)基因小鼠心肌組織學(xué)分析

為了確定壓力負(fù)荷下轉(zhuǎn)基因表達(dá)NRG2對(duì)心臟的肥厚抑制作用，是抵抗了肥厚過程，還是縮短了肥厚過程而加速了心衰進(jìn)程，對(duì)2月齡NRG2轉(zhuǎn)基因和同窩陰性小鼠進(jìn)行TAC手術(shù)處理，于術(shù)后4周時(shí)，對(duì)小鼠的心臟進(jìn)行病理組織學(xué)觀察，分析心肌結(jié)構(gòu)形態(tài)與纖維化改變。結(jié)果顯示，NRG2轉(zhuǎn)基因小鼠手術(shù)小鼠心室壁增厚程度顯著下降，心室腔增大，同時(shí)心肌排列紊亂程度和纖維化程度明顯比NTG小鼠嚴(yán)重，說明在壓力負(fù)荷下，轉(zhuǎn)基因表達(dá)NRG2縮短了肥厚過程，同時(shí)加速了心衰進(jìn)程 （封底圖4）。

3 討論

NRG2與NRG1基因結(jié)構(gòu)最為相似，其表皮生長(zhǎng)因子樣結(jié)構(gòu)域即具有和ErbB受體相互作用的功能，它以不同程度的親和力直接和ErbB2、ErbB4結(jié)合，而ErbB2和ErbB4促進(jìn)神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育及神經(jīng)肌肉間的連接，對(duì)維持心臟的功能具有重要作用［10］。NRG2在成年大鼠中的表達(dá)主要分布于肝和肺以及腦組織中的小腦和嗅球；NRG2在小鼠的整個(gè)神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育階段都有表達(dá)，能夠促進(jìn)神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育及神經(jīng)肌肉間的連接，且在9.5 d小鼠胚胎中主要表達(dá)于心臟的心房結(jié)構(gòu)［3，8-9］。NRG2異構(gòu)體種類多樣，其中人的NRG2γ和β具有抵抗血管生成的作用［3］，而NRG2敲除小鼠表現(xiàn)出早期生長(zhǎng)發(fā)育遲緩，增加剛出生幼崽的死亡率的的情況。這些皆提示NRG2可能參與心臟病生理進(jìn)程，然而目前尚無關(guān)于NRG2在心臟發(fā)育及相關(guān)心臟疾病調(diào)控的研究報(bào)道，所以本文建立了心臟組織特異性過表達(dá)NRG2轉(zhuǎn)基因小鼠，研究其于心臟發(fā)育己心臟疾病調(diào)節(jié)中的病生理作用［7］。

與NTG小鼠相比，NRG2轉(zhuǎn)基因小鼠LVPWD增加，表明NRG2作為一種生長(zhǎng)因子，具有促進(jìn)心臟發(fā)育的作用。NTG小鼠經(jīng)過TAC手術(shù)處理后的LVEDV有微弱的下降，而轉(zhuǎn)基因小鼠經(jīng)過TAC手術(shù)處理后的LVEDV增加。NTG小鼠經(jīng)過TAC手術(shù)處理后的LVPWD增加明顯，高達(dá)37.0％，而NRG2轉(zhuǎn)基因小鼠LVIDD僅增加8.4％。說明轉(zhuǎn)基因表達(dá)NRG2，心臟在壓力負(fù)荷下的肥厚過程被抑制，而是表現(xiàn)為左心室擴(kuò)大的病理表型。本文利用的TAC重建小鼠模型是誘導(dǎo)心肌肥厚和心衰的常用方法［13］，其可模擬人類心血管疾病并可用于分析涉及心肌肥厚及心衰過程的相關(guān)研究工作，其原理是主動(dòng)脈經(jīng)結(jié)扎重建后，心臟左室負(fù)荷增加，心肌發(fā)生代償性肥厚反應(yīng)，小鼠最初形成心肌肥厚，但心臟很快失代償，心室發(fā)生擴(kuò)張并以時(shí)間依賴的方式逐漸發(fā)展為心衰，同時(shí)病理組織學(xué)改變與臨床表現(xiàn)類似。

結(jié)合本文超聲及病理組織學(xué)分析的結(jié)果，在壓力負(fù)荷，NRG2過表達(dá)可使小鼠心臟由代償期更快進(jìn)入失代償期，轉(zhuǎn)基因表達(dá)NRG2縮短了肥厚過程，同時(shí)加速了心衰進(jìn)程。

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The establishment of cardiac-specific human Neuregulin-2 transgenic m ice and cardiacfunction analysis

LU Ying-dong，BAO Dan，LIU Ning，ZHANG Xu，MA Yuan-wu，LV Dan，ZHANG Lian-feng
（Key Laboratory of Human Diseases Comparative Medicine，Ministry of Health；Institute of Laboratory Animal Science，Chinese Academy of Medical Sciences（CAMS）＆Comparative Medicine Centre，Peking Union Medical College（PUMC），Beijing 100021，China）

Objective To study the effects of NRG2 on cardiac structure and function，we established the cardiac -specific human NRG2 transgenic mice and investigate the effect of NRG2 on cardiac structure and function under pressure overload situation.M ethods The transgenic vector was constructed by insertion of the human NRG2 gene under theα-MHC promoter.The transgenic mice were generated by microinjection and were all maintained on a C57BL/6J genetic background.The genotype of transgenic mice was identified by PCR and the expression level of target gene wasdetermined by western blot.Transverse aortic constriction（TAC）was applied to prepare the pressure overload induced cardiomyopathymicemodel.The cardiac structure and function of the transgenic mice were compared and analysized by echocardiographic and pathological observation.Results Transgenic mice with high level of NRG2 in heart tissues were established.The left ventricular wall thickness（LVPWD）was increased，and to 15.6％at 3 months old compared with that of the non transgenic（NTG）mice.The hypertrophy of left ventricular wall caused by pressure overload was removed due to the expression of NRG2.Meanwhile，cardiac disarray and fibrosis were increased obviously compared with that of the NTGmice.Conclusion The transgenic expression of NRG2 in heart tissues could shorten the pathological process of hypertrophy，but accelerated the process of heart failure（HF）.

NRG2；Transgene；Pressure overload；Ventricular remodeling

R332

A

1671-7856（2014）03-0078-05

10.3969.j.issn.1671.7856.2014.003.016

國家科技支撐計(jì)劃課題（2012BA139B02）。

路迎冬（1988年-），女，碩士生，研究方向：比較醫(yī)學(xué)。E-mail：luyd@cnilas.org。

張連峰。E-mail：zhanglf@cnilas.org。

2014-02-20