急性低壓缺氧對(duì)大鼠腎組織中生化指標(biāo)變化的研究

王 喆，郭廣進(jìn)，熊 敏，牛天慧

（空軍總醫(yī)院臨床航空醫(yī)學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室，北京 100142）

急性低壓缺氧對(duì)大鼠腎組織中生化指標(biāo)變化的研究

王 喆，郭廣進(jìn)，熊 敏，牛天慧

（空軍總醫(yī)院臨床航空醫(yī)學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室，北京 100142）

目的 觀察急性低壓缺氧對(duì)大鼠腎組織中超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、還原型谷胱甘肽（GSH）、過氧化氫酶（CAT）及內(nèi)皮素（ET-1）和腫瘤壞死因子（TNF-α）的影響。方法 將24只雄性Wistar大鼠，體重180～220 g，隨機(jī)分成地面對(duì)照組和急性低壓缺氧組，急性低壓缺氧組又分成缺氧1組和缺氧2組，每組8只。急性低壓缺氧后10 min和24 h處死動(dòng)物，迅速取出腎臟進(jìn)行生化指標(biāo)的檢測(cè)，并采用免疫組織化學(xué)方法觀察腎組織內(nèi)皮素（ET-1）和腫瘤壞死因子（TNF-α）的表達(dá)情況。結(jié)果 急性低壓缺氧后，大鼠腎組織中SOD活性明顯下降（P＜0.01），缺氧1組CAT活性極顯著降低（P＜0.01），缺氧2組GSH活性顯著降低（P＜0.05），但MDA含量無明顯變化（P ＞0.05）。免疫組織化學(xué)染色顯示，ET-1和TNF-α表達(dá)均明顯增強(qiáng)，24 h后表達(dá)減弱。結(jié)論SOD、CAT和GSH活性明顯下降及ET-1及TNF-α表達(dá)明顯增強(qiáng)，可能參與了缺氧性腎損傷的病理過程。

急性低壓缺氧；超氧化物歧化酶；丙二醛；還原型谷胱甘肽；過氧化氫酶；內(nèi)皮素；腫瘤壞死因子

飛行員或初次進(jìn)入高原的指戰(zhàn)員在意外情況下會(huì)遭受急性低壓缺氧的影響。急性低壓缺氧對(duì)機(jī)體可產(chǎn)生多種影響，但主要集中在心臟、大腦及肝功能的研究，國(guó)內(nèi)曾報(bào)道急性低壓缺氧對(duì)大鼠腎功能和腎臟結(jié)構(gòu)均有損害［1-3］。有關(guān)低壓缺氧對(duì)大鼠腎組織生化指標(biāo)變化的研究報(bào)道較少。本實(shí)驗(yàn)研究超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、還原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）、過氧化氫酶（catalase，CAT）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）在低壓缺氧大鼠腎組織中的變化，并采用免疫組織化學(xué)方法觀察腎組織內(nèi)皮素（Endothelin，ET-1）和腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor alpha，TNF-α）的表達(dá)情況，為進(jìn)一步闡明低壓缺氧條件下腎損傷的機(jī)制提供依據(jù)，這方面的工作將有助于從更深層次闡明高空缺氧對(duì)人體的影響，從而建立更加有效的預(yù)防方法。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

24只雄性SPF級(jí)Wistar大鼠，體重180～200 g，購自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)［SCXK（軍）2007-004］。動(dòng)物飼養(yǎng)在屏障系統(tǒng)內(nèi)，許可證［SYXK（軍）2007-008］。動(dòng)物適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，開始正式實(shí)驗(yàn)。將大鼠隨機(jī)分成地面對(duì)照組和急性低壓缺氧組，低壓缺氧組又分成缺氧1組（缺氧后10 min）和缺氧2組（缺氧后24 h），每組8只。

1.2 儀器及試劑

動(dòng)物低壓艙（空軍航空醫(yī)學(xué)研究所研制），UV-2201紫外分光光度計(jì)（日本島津），高速冷凍離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠），SOD、CAT、GSH和MDA檢測(cè)試劑盒（批號(hào)：20130618，南京建成生物工程研究所），ET-1多克隆抗體和TNF-α單克隆抗體（北京邦定公司提供）。

1.3 急性低壓缺氧實(shí)驗(yàn)

將低壓缺氧組大鼠放入動(dòng)物低壓艙后，以30 m/s的速度模擬上升至8000 m，停留30 min后，造成缺氧。然后以30 m/s的速度下降至地面［4］。對(duì)照組同時(shí)放入另一實(shí)驗(yàn)條件完全相同的動(dòng)物低壓艙30 min，不進(jìn)行低壓缺氧。

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1 腎組織生化指標(biāo)的測(cè)定：各組大鼠均在出艙后的時(shí)間點(diǎn)處死。所有動(dòng)物均用速眠新Ⅱ與氯胺酮復(fù)合麻醉致死，迅速取出同側(cè)腎臟，浸入冰生理鹽水中洗凈殘余血跡，濾紙吸干，剪取1 g組織，按W/V=1/9加入預(yù)冷的生理鹽水，勻漿后放入4℃的冷凍離心機(jī)，以3 000 r/min離心15 min，取上清液分別用于SOD、CAT、GSH、MDA的測(cè)定，腎組織中SOD、CAT活性及GSH、MDA含量測(cè)定的方法詳見南京建成生物工程研究所提供的測(cè)定試劑盒要求進(jìn)行操作。

1.4.2 免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)：采用SP法檢測(cè)各組大鼠腎組織ET-1和TNF-α的表達(dá)［5］。取每組大鼠左腎組織，石蠟包埋切片，厚2μm，烤片2 h，常規(guī)脫蠟至水，加0.1％Triton X-100常溫下處理10 min，3％過氧化氫-甲醇溶液處理15 min，10％ 山羊血清封閉15 min，分別加ET-1多克隆抗體和TNF-α單克隆抗體孵育，4℃過夜。16 h后加二抗，37℃處理30 min。DBA顯色，蘇木素復(fù)染，經(jīng)二甲苯透明后中性樹膠封片。組織呈黃褐色為ET-1和TNF-α陽性染色。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 腎組織生化指標(biāo)變化

與正常對(duì)照組比較，低壓缺氧組SOD活性極顯著降低（P＜0.01），缺氧2組GSH活性顯著降低（P＜0.05），缺氧1組CAT活性極顯著降低（P＜0.01），MDA含量組內(nèi)和組間比較均無顯著變化（P＞0.05）（表1）。

2.2 免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果

在正常對(duì)照組，ET-1和TNF-α的表達(dá)極低，缺氧1組有明顯表達(dá)，缺氧2組表達(dá)減弱（彩插5圖1）。

表1 大鼠腎組織生化指標(biāo)的變化Tab.1 Variations of biochemical index in the kidneys tissues of rats

3 討論

我國(guó)青藏高原平均海拔4500 m，自然環(huán)境十分惡劣，嚴(yán)重威脅高原居民和部隊(duì)官兵的身心健康和作業(yè)能力。應(yīng)用低壓低氧環(huán)境模擬裝置開展高原醫(yī)學(xué)的研究具有一定的現(xiàn)實(shí)意義。大型復(fù)合低壓艙的研制成功，為高原環(huán)境下軍地人員作業(yè)能力的醫(yī)學(xué)保障研究提供了一種實(shí)驗(yàn)平臺(tái)［6］。小型動(dòng)物低壓艙的應(yīng)用，為開展許多高原醫(yī)學(xué)的研究提供了結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、成本低、實(shí)用、穩(wěn)定的低壓低氧環(huán)境，我們應(yīng)用動(dòng)物低壓艙進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)工作，均取得良好的實(shí)驗(yàn)效果。

在正常生理?xiàng)l件下，處于平衡狀態(tài)下的自由基濃度很低，不但不會(huì)對(duì)機(jī)體造成損傷，而且還具有細(xì)胞信號(hào)調(diào)節(jié)、代謝、生存和凋亡等重要的生理功能。但是，當(dāng)環(huán)境中的物理因素或外源化學(xué)物質(zhì)直接或間接誘導(dǎo)產(chǎn)生的大量自由基超過了機(jī)體的清除能力，或內(nèi)源性自由基產(chǎn)生和清除失去平衡，使機(jī)體處于氧化應(yīng)激狀態(tài)中。自由基可與生物大分子共價(jià)結(jié)合和使生物膜脂質(zhì)過氧化而產(chǎn)生各種毒性效應(yīng)，從而損害細(xì)胞的結(jié)構(gòu)與功能，導(dǎo)致許多疾病的發(fā)生與發(fā)展。為保護(hù)機(jī)體免受過氧化損傷，細(xì)胞形成一套復(fù)雜的抗氧化酶防御系統(tǒng)，這個(gè)系統(tǒng)主要包括SOD、CAT、GSH等，其中SOD把超氧陰離子（）轉(zhuǎn)換為過氧化氫（H2O2），CAT再把H2O2轉(zhuǎn)化為水，從而有毒性的和H2O2均被轉(zhuǎn)化為無害的水分子；GSH在被催化下，實(shí)現(xiàn)向氧化型谷胱甘肽的轉(zhuǎn)變，使氧化型物質(zhì)還原，解除其毒性［7］。低壓缺氧后動(dòng)物血液及某些臟器的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)增強(qiáng)，脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA含量能直接反映體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的強(qiáng)度和速度。國(guó)外報(bào)道大鼠血中MDA的濃度隨缺氧時(shí)間延長(zhǎng)而增加。國(guó)內(nèi)也有報(bào)道9000 m重度缺氧主要造成心、腦、肺的過氧化損傷，而肝腎不明顯。這可能與前3種組織主要是以有氧代謝為主有關(guān)［8］。

關(guān)于急性低壓缺氧引起腎損傷的確切機(jī)制，目前還不十分清楚。從本研究結(jié)果看，在急性低壓缺氧后，腎組織中的SOD、GSH和CAT活性顯著降低，說明腎臟的抗脂質(zhì)過氧化能力已有顯著減退，所引起的氧自由基代謝失衡是誘發(fā)腎損傷的主要原因。但MDA含量無顯著變化，這些結(jié)果與俞啟福等報(bào)道相一致［9］，說明急性低壓缺氧應(yīng)激刺激對(duì)腎組織MDA含量影響不明顯。

ET-1是血管內(nèi)皮細(xì)胞、支氣管粘膜上皮細(xì)胞分泌，具有較強(qiáng)的縮血管活性。缺氧可使ET合成增加。已知腎血管對(duì)ET的縮血管效應(yīng)比其他血管床敏感10倍［10］。TNF-α受體存在血管內(nèi)皮細(xì)胞表面，當(dāng)TNF-α在血液中異常增生時(shí)，可損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞，造成血管內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)改變，細(xì)胞膜及細(xì)胞器損害等［11-12］。腎組織中的TNF-α可來源于循環(huán)血中的白細(xì)胞，也可來源于腎小球固有的系膜細(xì)胞、腎小球臟層上皮細(xì)胞和腎小球上皮細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)對(duì)腎組織ET-1和TNF-α表達(dá)的情況發(fā)現(xiàn)：急性低壓缺氧組的表達(dá)明顯強(qiáng)于正常對(duì)照組。這可能說明急性低壓缺氧引起的腎損傷可產(chǎn)生更多的細(xì)胞因子，ET-1和TNF-α既是其中的兩種。有關(guān)細(xì)胞因子在腎損傷中的作用機(jī)制今后還需進(jìn)一步研究。

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The study of acute hypobaric hypoxia on variation biochem ical index of renal tissue in rats

WANG Zhe，GUO Guang-jin，XIONG Min，NIU Tian-hui
（Aviation Medicine Research Lab，General Hospital of Air Force，Beijing 100142，China）

Objective To observe the effect of superoxide dismutase（SOD），malondialdehyde（MDA），glutathione（GSH），catalase（CAT）and endothelin（ET-1）and tumor necrosis factor alpha（TNF-α）on rat renal tissue under acute hypoxia.M ethods 24 male Wistar rats，weight180～220 g，were random ly divided into control group and acute hypobaric hypoxia group.Acute hypoxia group was divided into 2 groups hypoxia 1 and hypoxia 2，8 rats for each group.After acute hypobaric hypoxia 10min and 24h，rats were sacrificed.The left removed kidneys were analyzed for biochemical indexes，and the right parts were observed by immunohistochemistry to evaluate the expression level of renal endothelin（ET-1）and tumor necrosis factor alpha（TNF-α）.Results After acute hypobaric hypoxia，the activity of SOD of the rats kidney was greatly decreased（P ＜0.01），CAT activity of hypoxia group 1 was significantly decreased（P ＜0.01），GSH activity of hypoxia group 2 was significantly decreased（P ＜0.05），but the MDA content had no obvious change（P ＞0.05）.The immunohistochemical staining showed that，the expression level of ET-1 and TNF-αwas increased remarkably，but itwas reduced after 24 h.Conclusion The obviously decreased activity of SOD，CAT，GSH and significantly increased expression of ET-1 and TNF-α，may be involved in the pathogenesis of renal hypoxic injury.

Acure hypobaric hypoxia；Superoxide dismutase；Malondialdehyde；Glutathione；Catalase；Endothelin；Tumor necrosis factor alpha

R332

A

1671-7856（2014）03-0030-04

10.3969.j.issn.1671.7856.2014.003.007

空軍總醫(yī)院面上項(xiàng)目（KZ2012041）。

王喆（1960-），男，副主任醫(yī)師，從事動(dòng)物實(shí)驗(yàn)工作。E-mail：wangzhe6019@sohu.com。

牛天慧（1981-），女，博士，從事分子生物學(xué)工作。E-mail：niuhui81@126.com。

2014-02-21

·征稿啟事·