不同色型瑪咖中總生物堿酸水提取工藝的優(yōu)化

高 斌,李雙玲,劉鳳靜,車文軍,馮 勵

(云南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院,云南昆明 650201)

瑪咖(Maca)是南美一年生或兩年生草本植物,在南美安第斯山區(qū)已經(jīng)有幾千年的栽培歷史[1],是不可缺少的作物之一。大量研究表明,瑪咖具有改善性功能[2]、抑制前列腺增生[3]、抗疲勞[4]、增強免疫力[5]、緩解更年期綜合癥[6]和抗氧化[7]等多種功效?，斂且环N營養(yǎng)豐富的食品資源,其蛋白質(zhì)含量較高;此外,瑪咖還含有瑪咖烯[8]、生物堿[9]、芥子油苷[10]、多酚類[11]等多種次生代謝物質(zhì),推測這些次生代謝物質(zhì)與瑪咖保健功效有著密切關(guān)系。

生物堿是一類廣泛分布于植物界中重要的天然有機(jī)化合物,生物堿也是瑪咖中重要的活性成分之一。研究表明,瑪咖生物堿可通過提高動物成熟卵泡小體數(shù)量、精子流動性和精子數(shù)量,顯著提高哺乳動物和魚類的生育力[12-13]。另外,瑪咖中的生物堿通過作用視丘下部和腦垂體,調(diào)節(jié)腎上腺、甲狀腺、胰腺、卵巢等內(nèi)分泌腺,平衡荷爾蒙,可用于治療女性更年期綜合征[14]。

生物堿提取工藝研究的相關(guān)文獻(xiàn)報道較多,大多采用溶劑提取法進(jìn)行提取[15-16]。目前,僅有關(guān)于瑪咖生物堿回流提取[17]和超聲提取[18]的報道,而關(guān)于瑪咖生物堿的酸水提取還未有報道。酸水提取法的原理是大多數(shù)生物堿在植物體內(nèi)是以鹽形式存在,以無機(jī)酸水對其進(jìn)行提取可使生物堿從大分子有機(jī)酸鹽轉(zhuǎn)變?yōu)樾》肿訜o機(jī)酸鹽,從而增大其在水中的溶解度。本實驗選擇云南麗江所產(chǎn)的黃色、紫色和黑色3種色型的瑪咖為原料,以pH2.0鹽酸水溶液為提取溶劑,料液比、提取溫度和提取時間為考察因素,以瑪咖生物堿提取率為指標(biāo)進(jìn)行單因素實驗,并通過正交試驗優(yōu)化了酸水提取瑪咖生物堿的工藝確定其最佳提取條件,以期為瑪咖生物堿的提取提供簡單、可靠的方法,同時為有效推動瑪咖相關(guān)產(chǎn)業(yè)發(fā)展提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

瑪咖 黃色、紫色、黑色3種色型,產(chǎn)自云南麗江,經(jīng)過曬干加工為粉末的袋裝瑪咖粉;烏頭堿標(biāo)準(zhǔn)品 純度≥98%,批號:110799-201106,中國藥品生物制品檢定所;其他化學(xué)試劑 均為分析純。

BSA124S型精密電子分析天平 賽多利斯科學(xué)儀器有限公司;PB-10/C型標(biāo)準(zhǔn)型pH計 上海精密儀器儀表有限公司;HH-4型電熱恒溫水浴鍋 江蘇金壇市環(huán)宇科技儀器總廠;UV2450S型紫外可見分光光度計 日本島津公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 瑪咖粉中總生物堿供試樣品溶液的提取 3種色型瑪咖粉各稱取5.0 g→含0.5%鹽酸蒸餾水浸泡12 h→提取液5000 r/min離心10 min,取上清液→等體積氯仿萃取酸水提取液3次→氨水調(diào)節(jié)提取液pH至10左右→氯仿等體積萃取3次→合并萃取液,回收氯仿→脂溶性生物堿→正丁醇等體積萃取堿性水溶液3次,回收正丁醇→水溶性生物堿。脂溶性生物堿和水溶性生物堿合并,獲取3種色型瑪咖總生物堿。將3種色型瑪咖總生物堿分別合并蒸發(fā)濃縮至5 mL,即可獲取瑪咖總生物堿供試樣品溶液[19]。

1.2.2 瑪咖樣品總生物堿含量的測定 本實驗采用比色法對3種色型瑪咖樣品中總生物堿的含量進(jìn)行測定。由于瑪咖生物堿基礎(chǔ)性研究較少,無法獲取其標(biāo)準(zhǔn)品,有學(xué)者在研究瑪咖生物堿時以烏頭堿作為標(biāo)準(zhǔn)品[18],因此,本實驗也采用烏頭堿作為標(biāo)準(zhǔn)品。

用50 mL氯仿溶解50.0 mg烏頭堿樣品,得到濃度為1.0 mg/mL的烏頭堿對照品溶液。

精密吸取瑪咖樣品溶液及烏頭堿對照品溶液各1.0 mL,分別置于25 mL磨口試管中,用氯仿定容。其后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線制備方法進(jìn)行樣品的準(zhǔn)備,然后在300～700 nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行掃描。結(jié)果表明,瑪咖樣品在410～416 nm處有最大吸收峰,烏頭堿樣品在412～414 nm處有最大吸收峰,因此選擇412 nm為瑪咖生物堿的檢測波長。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作:分別量取0.0、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0 mL濃度為1.0 mg/mL的烏頭堿溶液,將其注入25 mL容量瓶中,用氯仿定容;然后在各容量瓶中分別加入2.0 mL 0.5%溴甲酚綠顯色劑和6 mL NaOH-KHC8H4O4緩沖液(pH4.0),振搖2 min;最后將其倒入分液漏斗中靜置1 h,使水層和氯仿層分清后,將分出的氯仿層用脫脂棉過濾,在412 nm波長處測定吸光度,制作烏頭堿標(biāo)準(zhǔn)曲線。

3種色型瑪咖總生物堿含量測定:將1.2.1所獲取的濃縮液定容至5 mL,移取1 mL于25 mL容量瓶中,其余與標(biāo)準(zhǔn)曲線操作相同。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線找出所獲取吸光值所對應(yīng)的總生物堿濃度,計算出總生物堿含量。瑪咖總生物堿提取得率(%)=總生物堿量/干瑪咖粉量×100

1.2.3 單因素實驗 稱取瑪咖粉5.0 g 5份,分別用pH2.0的鹽酸水溶液100、125、150、175、200 mL進(jìn)行加熱浸提,提取溫度設(shè)為80 ℃,每次5 h,重復(fù)提取3次,考察料液比對3種色型瑪咖中總生物堿提取得率的影響。

3種瑪咖粉在料液1∶30 (g/mL),提取時間5 h的條件下,分別按70、75、80、85、90 ℃的提取溫度處理瑪咖,重復(fù)提取3次,考察提取溫度對瑪咖中總生物堿提取得率的影響,篩選出較佳提取溫度。

三種瑪咖粉料液比1∶30 (g/mL)、提取溫度80 ℃的條件下,分別按4、4.5、5、5.5、6 h的提取時間處理瑪咖,重復(fù)提取3次,考察提取時間對瑪咖中總生物堿提取得率的影響,篩選出較佳提取時間。

3種瑪咖粉均以料液比1∶30 (g/mL)、提取時間5 h、提取溫度80 ℃的相同處理條件,分別按1、2、3次的提取次數(shù)處理瑪咖,考察提取次數(shù)對瑪咖中總生物堿提取得率的影響,篩選出較佳提取次數(shù)。

1.2.4 正交試驗優(yōu)化酸水提取法 提取條件在上述單因素實驗的基礎(chǔ)上,選擇對瑪咖中總生物堿提取得率影響比較大的因素,較好的水平進(jìn)行正交試驗,得到用酸水提取法提取瑪咖總生物堿的最優(yōu)因素水平。實驗選取料液比、提取溫度和提取時間3個因素為變量,選用3因素3水平正交表進(jìn)行,對正交試驗的操作設(shè)計如表1所示(3種色型瑪咖)。

表1 酸水提取各因素正交表Table 1 Orthogonal design experiment of acid water extraction

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 烏頭堿標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程

烏頭堿標(biāo)準(zhǔn)曲線制作結(jié)果,得到回歸方程為A=2.7653C-0.021,R2=0.9951,A代表吸光值,C代表烏頭堿濃度(mg/mL),烏頭堿濃度在30～320 μg/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,可用于樣品總生物堿的測定。

2.2 單因素實驗結(jié)果

2.2.1 料液比對瑪咖總生物堿提取得率的影響 料液比對瑪咖總生物堿提取得率的影響如圖1所示。由圖1可知,其他條件一定,當(dāng)料液比為1∶30 (g/mL)時,黃色瑪咖中總生物堿提取得率達(dá)到最大,為7.96%;當(dāng)料液比為1∶25 (g/mL)時,紫色和黑色瑪咖中總生物堿提取量達(dá)到最大,分別為9.95%、9.44%。故利用酸水提取法對黃色、紫色和黑色瑪咖中總生物堿最佳料液比的選擇應(yīng)該分別在1∶30、1∶25、1∶25 (g/mL)處。在本實驗料液比梯度內(nèi),3種色型瑪咖總生物堿最高提取得率的料液比不一致,推測與各總生物堿組成成分存在的差異相關(guān),但這還需要進(jìn)一步的研究來確定[21],適宜的料液比可使物料中的總生物堿有效溶出。

圖1 料液比對瑪咖中總生物堿提取得率的影響Fig.1 Effects of proportion of solid and liquidon extracting rate of total alkaloids

2.2.2 提取溫度對瑪咖總生物堿提取得率的影響 溫度升高,氣泡中的蒸氣壓增大,空化強度會降低;隨著溫度的升高，部分生物堿結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定,發(fā)生分解。提取溫度對瑪咖總生物堿提取得率的影響如圖2所示。由圖2可以看出:黃色瑪咖總生物堿提取得率到80 ℃最高,然后下降,故采用80 ℃為宜,此時瑪咖總生物堿提取得率為9.01%。紫色瑪咖總生物堿提取率在80～90 ℃范圍內(nèi)逐漸升高,故采用90 ℃為宜,此時瑪咖總生物堿提取得率為9.87%;黑色瑪咖總生物堿提取得率在70～75 ℃范圍內(nèi)顯著升高(p<0.05),到80 ℃時下降,故對黑色瑪咖總生物堿的提取采用75 ℃為宜,此時瑪咖總生物堿提取得率為9.39%;適宜的溫度有利于目標(biāo)生物堿的析出,但當(dāng)溫度超過一定溫度后,瑪咖總生物堿的提取得率開始下降。這可能與溫度過高導(dǎo)致部分對溫度較敏感的生物堿的結(jié)構(gòu)被破壞有關(guān),而且此時高溫對瑪咖總生物堿的結(jié)構(gòu)破壞作用要大于隨溫度升高而帶來的生物堿析出率增高的影響。

圖2 提取溫度對瑪咖中總生物堿提取得率的影響Fig.2 Effects of temperatures on extractingrate of total alkaloids

2.2.3 提取時間對瑪咖總生物堿提取得率的影響 提取時間對瑪咖總生物堿提取得率的影響如圖3所示。由圖3可以看出:黃色、紫色、黑色3種色型瑪咖的最佳提取時間分別為5.5、5.0、5.5 h,此時3種色型瑪咖總生物堿提取得率分別為8.23%、8.88%和9.56%。適宜的提取時間促進(jìn)瑪咖生物堿的溶出。

圖3 提取時間對瑪咖中總生物堿提取得率的影響Fig.3 Effect of time on extracting rate of total alkaloids

2.2.4 提取次數(shù)對瑪咖總生物堿提取得率的影響 提取次數(shù)對瑪咖總生物堿提取得率的影響如圖4所示。由圖4可以看出:3種色型瑪咖在提取1次和提取2次的瑪咖總生物堿提取得率之間存在顯著性差異(p<0.05),而部分瑪咖在提取2次與提取第3次的提取效果不顯著,經(jīng)過2次提取后,3種色型瑪咖中生物堿基本會被比較完全地提取。所以從操作周期考慮,將提取2次作為3種色型瑪咖總生物堿的最佳提取次數(shù)因素。

圖4 提取次數(shù)對瑪咖中總生物堿提取得率的影響Fig.4 Effects of times on extracting rate of total alkaloids

2.3 正交實驗結(jié)果

2.3.1 黃色瑪咖總生物堿最佳提取工藝條件 正交實驗在單因素試驗的基礎(chǔ)上,以對黃色瑪咖總生物堿提取量影響較大的因素和較好的條件作為因素水平進(jìn)行正交試驗,優(yōu)化出提取黃色瑪咖中總生物堿的最佳條件。正交試驗結(jié)果如表2。

由表2中可以看出,提取料液比的極差最大(0.880),說明料液比對黃色瑪咖總生物堿提取得率的影響相對關(guān)鍵,提取時間對提取得率的影響次之,而提取溫度對提取得率的影響相對較小。根據(jù)正交試驗極差分析結(jié)果得出黃色瑪咖總生物堿酸水提取的最佳提取工藝為A3B1C2,即提料液比為1∶30 (g/mL),取溫度75 ℃,提取時間為5.5 h。在此條件下進(jìn)行了3次驗證實驗,測得瑪咖中總生物堿提取得率為9.89%±0.38%。

表2 黃色瑪咖總生物堿提取工藝條件正交試驗設(shè)計與結(jié)果Table 2 Yellow Maca total alkaloid extractionconditions of orthogonal array design

2.3.2 紫色瑪咖總生物堿最佳提取工藝條件 正交實驗在單因素試驗的基礎(chǔ)上,以對紫色瑪咖總生物堿提取量影響較大的因素和較好的條件作為因素水平進(jìn)行正交試驗,優(yōu)化出提取紫色瑪咖中總生物堿的最佳條件。正交試驗結(jié)果如表3。

表3 紫色瑪咖總生物堿提取工藝條件正交試驗結(jié)果Table 3 Purple Maca total alkaloid extractionconditions of orthogonal array design

由表3中可以看出,提取時間的極差最大(1.403),說明提取時間對紫色瑪咖總生物堿的提取得率影響最大,其次是料液比,最后是提取溫度。試驗結(jié)果表明,各因素影響程度大小為提取時間>料液比>提取溫度。即紫色瑪咖總生物堿酸水提取工藝條件為A2B3C3,即料液比1∶25 (g/mL),提取溫度90 ℃,提取時間為5.5 h,在此條件下進(jìn)行了3次驗證實驗,測得瑪咖中生物堿提取得率為10.36%±0.58%。

2.3.3 黑色瑪咖總生物堿提取工藝條件 正交實驗在單因素試驗的基礎(chǔ)上,以對黑色瑪咖總生物堿提取量影響較大的因素和較好的條件作為因素水平進(jìn)行正交試驗,優(yōu)化出提取黑色瑪咖中總生物堿的最佳條件。正交試驗結(jié)果如表4。

表4 黑色瑪咖總生物堿提取工藝條件正交試驗結(jié)果Table 4 Black Maca total alkaloid extractionconditions of orthogonal array design

由表4中可以看出,料液比的極差最大(1.050),說明料液比對黑色瑪咖總生物堿的提取得率的影響最大,其次是提取時間,最后是提取溫度。試驗結(jié)果表明,各因素影響程度大小為料液比>提取時間>提取溫度。根據(jù)正交試驗極差分析得出,黑色瑪咖總生物堿酸水提取工藝條件為A1B3C3,即料液比為1∶20 (g/mL),提取溫度85 ℃,提取時間為6.0 h。該組合已在正交試驗中進(jìn)行了3次測定,測得瑪咖中總生物堿提取得率為10.01%±0.78%。

3 結(jié)論

瑪咖的種植中有黃、紫、黑3種色型,本實驗利用酸水提取法對3種色型的瑪咖本的總生物堿提取得率進(jìn)行優(yōu)化發(fā)現(xiàn),黃、紫、黑3種色型瑪咖最佳提取單因素存在一定的差異。通過單因素試驗和正交試驗的優(yōu)化,確定酸水提取3種色型瑪咖中總生物堿的最佳條件如下:黃色瑪咖的最佳提取工藝條件為料液比1∶30 (g/mL),提取溫度75 ℃,提取時間5.5 h,在此條件下獲得的瑪咖總生物堿提取得率為9.89%±0.38%;紫色瑪咖的最佳提取工藝條件為料液比為1∶25 (g/mL),提取溫度90 ℃,提取時間5.5 h,在此條件下獲得的瑪咖總生物堿提取率為10.36%±0.58%;黑色瑪咖的最佳提取工藝條件為料液比為1∶20 (g/mL),提取溫度85 ℃,提取時間6 h,在此條件下獲得的瑪咖總生物堿提取得率為10.01%±0.78%。本研究表明,不同色型瑪咖中總生物堿的最佳提取條件有一定差異,或與其各色型瑪咖生物堿組成成分的差異相關(guān),這可為瑪咖生物堿研究者提供一定參考。