內(nèi)源性神經(jīng)肽對(duì)大鼠心肌缺血再灌注引起心肌損傷的影響

[摘要] 目的 研究內(nèi)源性神經(jīng)肽對(duì)大鼠心肌缺血再灌注引起心肌損傷的影響，探討內(nèi)源性神經(jīng)激肽在心肌缺血再灌注損傷中的病理生理學(xué)作用。 方法 健康成年雄性SD大鼠40只，體重350～400 g，隨機(jī)分為5組（n = 8）：假手術(shù)組S（只穿線，不結(jié)扎冠狀動(dòng)脈）、缺血再灌注組IR（靜脈給予生理鹽水）、不同濃度[（10-11） mol/kg，（10-10） mol/Kg和（10-9） mol/kg]神經(jīng)激肽-1（NK1）受體拮抗劑（[D-Arg1，D-Phe5，D-Trp7，9，Leu11]-SubstanceP，D-SP）組。缺血再灌注組和各給藥組均結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支30 min，然后松開結(jié)扎線再灌120 min，按1 μl/g劑量于再灌前5 min給藥。用分光光度法檢測(cè)各組Caspase-3活性；用TTC法及BI-2000醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)測(cè)定缺血面積和梗死面積。 結(jié)果 1）和IR組相比，S組的Caspase-3活性降低（P < 0.05），D-SP10-10組升高24%（P < 0.01）；（2）和IR組相比，各給藥組的缺血面積略有增高（P > 0.05），和IR組相比，D-SP10-10組梗死面積顯著增高（P < 0.01）。 結(jié)論 內(nèi)源性神經(jīng)肽在大鼠缺血再灌注損傷中可能發(fā)揮著抗凋亡及損傷，保護(hù)心肌的作用。

[關(guān)鍵詞] 心肌缺血再灌注；內(nèi)源性神經(jīng)肽；P物質(zhì)； Caspase-3；梗死面積

[中圖分類號(hào)] R542.2 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-9701（2013）12-0015-03

急性心肌梗死是常見的危重癥之一[1]，盡快有效的恢復(fù)血液灌流被認(rèn)為是防治心肌缺血損傷的根本措施。然而，大多數(shù)研究表明心肌在恢復(fù)供血后不但不減輕或逆轉(zhuǎn)損傷，反而加重?fù)p傷，且細(xì)胞凋亡可能是心肌缺血再灌注損傷發(fā)病機(jī)制的重要環(huán)節(jié)之一[2]。P物質(zhì)（SP）是發(fā)現(xiàn)最早的一種神經(jīng)肽，是神經(jīng)激肽的代表物質(zhì)，其分布廣泛，參與機(jī)體多種功能的調(diào)節(jié)，尤其對(duì)心血管功能的影響。前期研究表明SP可通過調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞PKA活性，抑制由NE誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，對(duì)心肌具有保護(hù)作用[3]。本實(shí)驗(yàn)擬探討內(nèi)源性神經(jīng)激肽對(duì)在體大鼠缺血再灌注所致的心肌損傷的影響。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.2 分光光度法檢測(cè)Caspase-3活性 各實(shí)驗(yàn)組均在再灌120 min末開胸，迅速取出大鼠心臟用冰生理鹽水沖洗干凈，取左室壁相同部分缺血區(qū)心肌組織置于EP管，液氮冷凍5 min后置于-70℃低溫冰箱保存待測(cè)樣品稱重，按10 μL/mg加入裂解液，4℃高速離心后取上清，采用BCA法測(cè)定蛋白濃度，按照碧波Caspase-3活性分光光度法檢測(cè)試劑盒說明檢測(cè)各組Caspase-3活性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 統(tǒng)計(jì)軟件，數(shù)據(jù)均表示為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s），組間均數(shù)比較采用單因素方差分析（ANOVA），兩組間比較采用t檢驗(yàn)，P < 0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

3 討論

研究表明，心肌細(xì)胞凋亡參與了冠心痛、心律失常等心血管疾病的形成和發(fā)展過程，缺血再灌注損傷時(shí)心肌細(xì)胞凋亡也明顯加重[4]。采用在體家兔心肌缺血再灌注模型發(fā)現(xiàn)，單純?nèi)毖?0 min、4.5 h和缺血5 min再灌注4 h的心肌細(xì)胞均未出現(xiàn)凋亡現(xiàn)象，而缺血30 min再灌注4 h的心肌細(xì)胞則出現(xiàn)了凋亡，因此認(rèn)為凋亡是心肌對(duì)缺血再灌注損傷的一個(gè)特殊反應(yīng)[5]。Caspase（天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶）是一類在進(jìn)化上非常保守的蛋白酶類，Caspase-3被認(rèn)為是各種凋亡刺激因子激活的Caspase家族中的關(guān)鍵蛋白酶，與DNA斷裂、染色體凝聚和凋亡小體形成有關(guān)，是直接介導(dǎo)凋亡的效應(yīng)分子[6]。目前已證實(shí)Caspase-3是三條途徑即細(xì)胞表面受體途徑、線粒體途徑、及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑的最終主要激活凋亡效應(yīng)酶[7]，生理狀態(tài)下，Caspase-3以無活性的酶原形式存在，凋亡信號(hào)可導(dǎo)致Caspase-3激活，活化的Caspase-3由兩個(gè)大亞基和兩個(gè)小亞基組成，裂解相應(yīng)的胞漿和胞核底物，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[8]。因此，Caspase-3活性測(cè)定成為凋亡相關(guān)研究的重要指標(biāo)。

SP作為一種神經(jīng)肽，同時(shí)也是重要的神經(jīng)遞質(zhì)/調(diào)質(zhì)[9]，參與了免疫調(diào)節(jié)、神經(jīng)炎性反應(yīng)等機(jī)體的各種調(diào)節(jié)，參與了心臟的病理或生理功能[10，11]。實(shí)驗(yàn)室前期研究表明SP可通過調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞PKA活性，抑制由NE誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡且NK1受體參與介導(dǎo)SP的抗凋亡作用[3]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，缺血再灌組Caspase-3活性高于假手術(shù)組，各給藥組的Caspase-3活性均有高于缺血再灌注組的趨勢(shì)，說明缺血再灌確實(shí)可導(dǎo)致細(xì)胞凋亡增加，這一結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道相一致，而對(duì)于SP在心肌缺血再灌注中發(fā)揮的作用，文獻(xiàn)報(bào)道少有，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)D-SP可引起心肌缺血再灌注細(xì)胞凋亡顯著加劇，提示內(nèi)源性神經(jīng)肽可能在缺血再灌注損傷中可發(fā)揮抗凋亡，對(duì)心肌具有保護(hù)作用。

正常心肌細(xì)胞含有脫氫酶，其在還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（reduced form of nicotinamide-adenine dinucleotid，NADH）存在的條件下可將無色的氧化型染料TTC還原成紅色的還原型TTC，從而使活體心肌染色。梗死的心肌細(xì)胞因細(xì)胞膜損傷造成脫氫酶丟失，無法將氧化型TTC還原，故不能使心肌染色。據(jù)此可將存活心肌與梗死心肌加以分離[12，13]。心肌梗死面積擴(kuò)大是心肌缺血再灌注損傷的一個(gè)重要特征，而梗死面積的多少?zèng)Q定著缺血再灌注對(duì)心肌損傷的嚴(yán)重程度[14-16]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，和缺血再灌注組相比，三個(gè)濃度給藥組心肌缺血面積均有升高趨勢(shì)，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而對(duì)于梗死面積，三個(gè)濃度給藥組也均高于對(duì)照組，但只有D-SP10-10有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），說明D-SP可加劇心肌再灌注損傷，導(dǎo)致梗死面積擴(kuò)大，D-SP10-10可能是最有效的濃度，提示內(nèi)源性神經(jīng)肽可能在缺血再灌損傷中具有抗損傷，保護(hù)心肌的作用。本實(shí)驗(yàn)觀察到，各給藥組的缺血面積均比缺血再灌組高，所以梗死面積的增加和缺血面積大有一定的關(guān)系。分析其原因一方面可能是主觀因素，在實(shí)驗(yàn)過程中給藥組結(jié)扎的缺血面積比較大。另一方面，研究表明SP能夠引起人和犬的冠狀動(dòng)脈舒張，從而在心臟缺血情況下形成自我保護(hù)[17]，給予D-SP后，冠脈血流量減少，導(dǎo)致缺血面積增加。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果總體表明，D-SP可能會(huì)引起細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致心肌梗死面積的增加，提示內(nèi)源性神經(jīng)肽在大鼠缺血再灌注損傷中可能發(fā)揮著抗損傷，保護(hù)心肌的作用，具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究和探討。

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（收稿日期：2013-03-13）