NINJ2基因功能單核苷酸多態(tài)性與腦梗死的相關性研究

冼文川，李新梅，朱薇薇

NINJ2基因功能單核苷酸多態(tài)性與腦梗死的相關性研究

冼文川1＊，李新梅2，朱薇薇2

（1.廣東醫(yī)學院附屬醫(yī)院神經(jīng)內科，廣東湛江524001；2.湛江中心人民醫(yī)院神經(jīng)內科，廣東湛江524001）

目的分析粵西地區(qū)漢族人群NINJ2基因功能單核苷酸多態(tài)性（Functional SNP，F(xiàn)－SNP）與腦梗死的關聯(lián)性。方法采用FASTSNP軟件篩選神經(jīng)損傷誘導蛋白基因2（NINJ2）的F－SNPs（rs34578646A／G和rs3809263A／G）。聯(lián)合聚合酶鏈反應－限制性片段長度多態(tài)性（PCR－RFLP）和等位基因特異性PCR（AS－PCR）方法，對278例腦梗死患者（病例組）和120例正常對照者（對照組）進行F－SNPs基因型檢測。結果病例組rs34578646A／G和rs3809263A／G的基因型頻率和等位基因頻率與對照組相比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。結論粵西地區(qū)漢族人群NINJ2基因功能單核苷酸多態(tài)性rs34578646A／G以及rs3809263A／G與腦梗死無關。

NINJ2基因；腦梗死；功能單核苷酸多態(tài)性

（Chin J Lab Diagn，2014，18：1996）

腦梗死是一種復雜的多因素疾病，多種環(huán)境因素和遺傳因素在其發(fā)病過程中相互作用。Ikram的研究提示位于染色體12p13上NINJ2基因的單核苷酸多態(tài)位點（SNPs）與腦梗死有關，但國內外國外研究結論并不一致［1，2］。本研究擬通過運用SNP功能分析（snp functional analysis）的方法來探討NINJ2基因功能單核苷酸多態(tài)性（（FunctionalSNP，F(xiàn)－SNP）與粵西地區(qū)漢族人腦梗死的相關性。

1 資料與方法

1.1病例與分組

病例組為我院2012年7月至2013年3月住院的患者，為粵西地區(qū)漢族人，共278例，均符合1995年全國第四次腦血管病學術會議制定的腦梗死標準，并經(jīng)頭部CT和（或）磁共振成像（MRI）確診。對照組為同期在我院健康體檢者，為粵西地區(qū)漢族人，共120例，排除腦血管病、冠心病、糖尿病、肝、腎、血液、自身免疫性疾病者。病例組缺血性腦卒中患者與對照組健康人群一般資料（性別、年齡、例數(shù)等）具有臨床可比性（P＞0.05）。

1.2方法

1.2.1 相關多態(tài)性位點的篩選 根據(jù)文獻［4］采用FASTSNP軟件篩選NINJ2的功能單核苷酸多態(tài)性（F－SNPs）。本研究中納入兩個位點，一個是位于編碼區(qū)的rs 34578646A／G，功能效應風險分值為2－3分，其可能的生物學效應為“在一個含有相同的蛋白質結構域的編碼序列中，打破外顯子剪接增強子或沉默子的結合位點”。另一個是位于5’－端上游非編碼區(qū)的rs3809263A／G，功能效應風險分值為1－3分，其可能的生物學效應為“不改變一個氨基酸，但可以影響一個基因的表達水平，地點或時間”。1.2.2 DNA的提取 抽取早晨空腹肘部靜脈血2 ml至含有EDTA－K2的抗凝試管，用溶液法（TIANamp Blood DNA System，北京天根生化科技有限公司）提取外周血白細胞的基因組DNA，將提取后剩下的血標本保存在－20℃。

1.2.3 DNA擴增 rs34578646A／G：采用等位基因特異性PCR（AS－PCR）法檢測，上游引物為：a1 5’TGTGCTTTCTCCCCTACAGCCTGGA’3a2 5’TATATGTGCTTTCTCCCCTACAGCCTGGG’3下游引物為：b 5’CAGGGTGGTGTAGTAGTGAGA＇3。PCR擴增：94℃預變性5min后，94℃45 s，53℃退火45s，72℃延伸90s，34個循環(huán)后再于72℃延伸10min。

rs3809263A／G：采用聚合酶鏈反應－限制性酶切片段長度多態(tài)性（PCR－RFLP）法檢測，引物為：上游5’TTGAATGTGGTGAGGGTA’3，下游5’GGAGCAGGGAGTAGTTGT’3。PCR擴增：94℃預變性5min后，94℃變性30s，60.5℃退火30s，72℃延伸60s，30個循環(huán)后再于72℃延伸10min。1.2.4 PCR擴增產(chǎn)物酶切及基因型分析rs34578646A／G位點PCR擴增后，擁有一條194 bp堿基片段的為AA型純合子；擁有一條198bp堿基片段的為GG型純合子；擁有194bp、198bp兩條堿基片段的為AG型雜合子。

rs3809263A／G位點的擴增片段長度為316 bp，經(jīng)限制性內切酶HpaI消化后擁有316bp、83 bp和233bp三條堿基片段的為AG型雜合子；擁有83bp和233bp兩條堿基片段的為GG型純合子；擁有一條316bp堿基片段的為AA型純合子。1.2.5 統(tǒng)計學分析 應用SPSS19.0統(tǒng)計軟件包和遺傳學數(shù)理統(tǒng)計方法進行統(tǒng)計分析。計算各組基因型和等位基因頻率，Hardy－Weinburg平衡吻合度和基因型頻率統(tǒng)計分析采用χ2檢驗，統(tǒng)計學顯著性定為P＜0.05。

2 結果

2.1 病例組rs34578646A／的基因型與等位基因頻率與對照組相比較差異無統(tǒng)計學意義（χ2＝0.249，P＝0.617）（見表1）。

表1 rs34578646 A／G多態(tài)性基因型頻率及等位基因頻率

2.2 病例組rs3809263A／G的基因型與等位基因頻率與對照組相比較差異無統(tǒng)計學意義（χ2＝ 0.394，P＝0.530）（見表2）。

表2 rs3809263 A／G多態(tài)性基因型頻率及等位基因頻率

3 討論

NINJ2基因位于染色體12p13.33，包括4個外顯子和3個內含子，編碼由142個氨基酸組成的約20KDa的蛋白質，即為神經(jīng)損傷誘導蛋白2（ninjurin2）。初步研究提示ninjurin2可表達于神經(jīng)系統(tǒng)，周圍神經(jīng)損害可誘導施萬細胞上調表達該蛋白以促進神經(jīng)突生長和神經(jīng)再生，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內ninjurin2的表達水平可能會影響腦部對缺血現(xiàn)象的耐受度［5］。

SNP功能分析（SNP functional analysis）是指對基因產(chǎn)物有影響的SNP（Functional SNP，F(xiàn)SNP）進行功能分析，可以為復雜疾病的大規(guī)模直接關聯(lián)分析法提供大量可靠的候選SNP標記，加快復雜疾病的致病基因定位的研究速度。既往對基因與疾病關系的研究主要集中在基因的編碼區(qū)。近年SNP數(shù)據(jù)的快速積累使得用計算方法對編碼區(qū)和非編碼區(qū)SNP進行功能分析成為可能［4］。

在本研究中，位于NINJ2基因編碼區(qū)Exon2的F－SNPs rs34578646與粵西地區(qū)漢族人群缺血性腦卒中無關聯(lián)。國內Wan XH等［6］研究顯示，位于NINJ2編碼區(qū)Intron1的rs10849373位點與中國人群缺血性卒中有關，而分別位于Exon1與Exon4的rs4980959與rs2245906這兩個位點與中國人群缺血性卒中無關，本研究結果與之類似。其原因可能是因為NINJ2基因Intron1的長度（97.1kB）比其他外顯子及內含子長得多（其他內含子及外顯子的長度由0.185kB到0.548kB不等），可能含有許多的轉錄調控轉錄的元素，如增強子和沉默子，從而在基因轉錄調控中發(fā)揮重要作用，這需要進一步的探索。

在本研究中，位于NINJ2基因5’－端上游非編碼區(qū)的rs3809263與粵西地區(qū)漢族人群缺血性腦卒中無關聯(lián)。Van等的研究提示NINJ2基因5’上游非編碼區(qū)兩個SNP，rs11833579和rs12425791的多態(tài)性與荷蘭人腦卒中的大血管病變有關［7］，但國內尚賢金等發(fā)現(xiàn)rs11833579GG基因型和G等位基因與福建地區(qū)漢族人動脈粥樣硬化型腦梗死發(fā)病無關聯(lián)［8］，本研究結果和尚賢金等相似。目前國際上多個研究結果不盡一致，究其原因可能是因為復雜疾病的易感基因往往受到特定種群遺傳結構的影響，同時樣本數(shù)上存在差異很大，可能對結果也有一定的影響。

綜上所述，在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)NINJ2基因的功能單核苷酸多態(tài)性位點rs 34578646、rs3809263與中國粵西地區(qū)漢族人的腦梗死無關。NINJ2基因功能單核苷酸多態(tài)性與腦梗塞的相關性還需要進一步行大樣本，多中心的研究證實。

［1］Ikram MA，Seshadri S，Bis JC，et al.Genome－wide association studies of stroke［J］.N Engl J Med，2009，360（17）：1718.

［2］陳 廓，肖占森，侯淑琴，等.NINJ2基因多態(tài)性與房山地區(qū)漢族腦卒中易感強相關［J］.北京大學學報（醫(yī)學版），2010，42（5）：498.

［3］Matsushita T，Umeno J，Hirakawa Y，et al.Association study of the polymorphisms on chromosome 12p13with atherothrombotic stroke in the Japanese population［J］.J Hum Genet，2010，55（7）：473.

［4］Hsiang－Yu Yuan，Jen－Jie Chiou，Wen－Hsien Tseng et al.FASTSNP：an always up－to－date and extendable service for SNP function analysis and prioritization［J］.Nucleic Acids Res，2006，34：635.

［5］Araki T，Milbrandt J.Ninjurin2，a novel homophilic adhesion molecule，is expressed in mature sensory and enteric neurons and promotes neurite outgrowth［J］.Neurosci，2000，20（1）：187.

［6］Wan XH，Li SJ，Cheng P，et al.NINJ2polymorphism is associated with ischemic stroke in Chinese Han population［J］.Neurol Sci，2011，308（1－2）：67.

［7］van den Herik，Evita G，de Lau，et al.Association of two single nucleotide polymorphisms from genomewide association studies with clinical phenotypes of cerebral ischemia［J］.Int J Stroke，2011，7（5）：219.

［8］尚賢金，王 檸，吳志英.染色體12p13兩基因間多態(tài)與腦梗死的關聯(lián)研究.［學位論文］.福建醫(yī)科大學學報，2011，11（5）：185.

The Association of NINJ2 gene Functional single－nucleotide polymorphisms with Cerebral Infarction

XIAN Wen－chuan1，LI Xin－mei2，ZHU Wei－wei2.（1.Department of Neurology，Affiliated Hospital of Guangdong Medical College；2.Department of Neurology，Central People’s Hospital of Zhanjiang，Zhanjiang524001，China）

ObjectiveTo investigate the relationship between cerebral infarction（CI）and the functional single nucleotide polymorphisms（F－SNPs）of NINJ2gene in Han population of the Western Guangdong province in China.MethodsThe F－SNPs of NINJ2gene（rs34578646A／G and rs3809263A／G）was screened by FASTSNP software.Genotype and allele frequency was analysis in 278cerebral infarction cases and 120healthy controls.ResultsThe frequencies of genotypes and allele in two polymorphisms（rs34578646A／G and rs3809263A／G）showed an insignificant difference between case and control groups（P＞0.05）.ConclusionTwo F－SNPs of NINJ2gene（rs34578646A／G and rs3809263A／G）were not associated with the risk of ischemic stroke.

NINJ2gene；cerebral infarction；functional single nucleotide polymorphisms（F－SNPs）

R743

：A

2014－01－15）

1007－4287（2014）12－1996－03

2012年湛江市科技攻關計劃項目編號：2012C3102024

＊通訊作者